超高活性胞嘧啶碱基编辑器开发成功

5月11日，华东师范大学生命科学学院李大力课题组在《自然-细胞生物学》杂志上发表了一篇论文，介绍了最近开发的超高活性胞嘧啶碱基编辑器。这种用于基础编辑的新工具的开发有望为基因治疗提供一种独立开发的新工具，并提高遗传疾病基因治疗的准确性和长期效果。

根据临床数据，58%的人类遗传病是由单碱基突变引起的。虽然Cas9激活的同源重组能准确地纠正突变位点，但其效率很低(0.1%~5%)，严重阻碍了它的应用。

然而，胞嘧啶碱基编辑器BE3(CBE)是由胞嘧啶脱氨酶和尼克酶Cas9(D10A)融合而成，在编辑窗口(PAM末端4-7位)对胞嘧啶进行脱氨，而不引入DNA双链断裂和重组修复模板，从而实现了C>T的碱基转换，具有更安全、更高效、更准确的特点，在基因治疗、作物遗传育种、药物筛选等领域显示出广阔的应用前景。

自CBE发明以来，各种策略得到了优化和改进。虽然这些方法在一定程度上提高了CBE的活性，但对编辑窗口的影响很小，特别是靠近PAM序列的碱基仍然难以编辑。因此，是否有新的策略可以改善编辑活动，扩大目标库的范围，一直是库编辑器优化的难点。

CBE主要使用单链DNA(ssDNA)作为底物。如果脱氨酶与ssDNA的结合能力增强，脱氨酶的作用时间是否会延长，活性是否会增强？该研究小组将10个非序列特异性ssDNA结合结构域与CBE融合。通过筛选发现，将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1和Cas9n之间，可以显著提高碱基编辑活性，同时编辑窗口也大大增加。通过对10个靶标的分析，研究人员发现在编辑窗口C4-c8中，hyBE4max的活性比BE4max高1.5~2倍，而靠近PAM的C9-c15碱基的活性则高18倍。

为了验证ssDBD的融合策略是否具有普适性，研究人员用类似的方法对特异性识别TC基序中c碱基的A3A—BE4max和eA3A—BE4max进行了改造，获得了Hy3A—BE4Max和hyA3A—BE4max。大量实验证明，与A3A—BE4max相比，Hy3A—BE4Max的活性在C3—c11位点提高了1.2—2倍，在C12—C17位点提高了3—4倍。小鼠胚胎显微注射进一步证明了其编辑碱基更接近PAM序列的独特优势。与eA3A—BE4max相比，hyeA3A—BE4max仍能非常特异地靶向t c基序中的c，编辑窗口从C4-9扩大到C4-15，最高活性提高了257倍，小鼠胚胎C13位的编辑活性也提高了近60倍，F0代小鼠获得DMD纯合子点突变的效率达到40%。

论文进一步验证了混合遗传算法，尤其是混合遗传算法，没有检测到未命中的目标，并且具有很高的准确性。

最后，通过比较各种CBE编辑胎儿血红蛋白启动子-117位点(HBG1/2)的能力，发现HYA3a能在红细胞前体细胞系中精确催化-117 g > a的转化，同时与周围有碱基突变的细胞相比具有更高的HBG表达水平，证明了HYA3a—BE4max在精确治疗β-血红蛋白疾病方面的巨大潜力。

这项工作开发了一系列新的CBE，可以改善编辑活动，扩大目标范围，为基础研究和基因治疗提供新的优化工具。

该研究得到了科技部、国家自然科学基金和上海市教委重大项目的支持。

相关论文信息:https://doi.org/10.1038/s41556-020-0518-8