细胞子刊：中国团队发现新蝙蝠冠状病毒，力证新冠起源于自然

最新研究表明，去年在云南省勐腊县采集的蝙蝠样本中发现了一种新的冠状病毒。该病毒在最长编码基因区1ab与新冠状病毒(SARS-CoV-2)的一致性达到97.2%。与此同时，研究小组还发现，在这种新的冠状病毒的S蛋白(尖峰糖蛋白)S1和S2的连接处插入了三个残基PAA。因此，他们认为在S1和S2交界处插入4个氨基酸的非典型肺炎冠状病毒-2不是“人工痕迹”，这有力地证明了它起源于自然。

当地时间5月10日，Cell旗下的当代生物学在线发布了“一种与SARS-CoV-2密切相关的新型蝙蝠冠状病毒在S1/ S2棘突蛋白切割位点含有天然插入物”，来自山东第一医科大学、山东省高校新发传染病流行病学实验室、中国科学院西双版纳热带植物园、中国科学院北京生命科学研究所、中国科学院武汉病毒研究所、中国科学院微生物研究所和澳大利亚悉尼大学的研究人员得出了上述结论。

在这篇论文中，研究小组报告了一种新的蝙蝠来源的冠状病毒，命名为RmYN02，它是从2019年5月至10月从中国云南省收集的227只蝙蝠的基因组分析中鉴定的。

研究表明，新型冠状病毒中的RmYN02和SARS-CoV-2在全病毒基因组中具有93.3%的同源性，在最接近SARS-CoV-2的1ab基因中具有97.2%的同源性。相比之下，RmYN02受体结合结构域(RBD)与非典型肺炎冠状病毒-2具有低序列同源性(61.3%)，可能不与血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。

然而，与SARS-CoV-2相似，RmYN02的特征是在S蛋白的S1和S2亚基的切割位点有多个氨基酸插入。研究小组认为，这有力地证明了这种插入事件在自然界中是可能发生的。

这些数据表明，非典-CoV-2起源于蝙蝠和其他野生动物体内存在的病毒之间的多重自然重组。

本文作者是山东第一医科大学基础医学院病原生物学研究所所长、山东省高校新发传染病流行病学实验室主任石伟峰；中国科学院微生物研究所病毒传播预警与发病机制研究组组长、项目研究员毕玉海；爱丽丝·凯瑟琳·休斯，中国科学院西双版纳热带植物园景观生态组组长、综合保护中心副教授。该研究先前于当地时间3月5日发表在预先打印好的网站bioRxiv上。

新冠状病毒的来源仍不清楚，野生动物中仍有大量冠状病毒。

SARS-CoV-2在中国及其他地区引起了前所未有的肺炎流行，引起了全世界公众健康的关注。尽管蝙蝠被认为是最有可能的SARS-CoV-2的自然宿主，但该病毒的来源仍不清楚。

系统发育分析表明，SARS-CoV-2是一种不同于SARS-CoV和MERS-CoV的新型冠状病毒。到目前为止，与SARS-CoV-2最密切相关的病毒是鼠13，它是由中国科学院武汉病毒研究所的史团队于2013年在云南分离并发现的。鼠13病毒株与新冠状病毒具有96.1%的核苷酸同源性和92.9%的S基因同源性。这些数据再次表明蝙蝠是冠状病毒的重要宿主。

然而，值得注意的是，香港大学公共卫生学院新发传染病国家重点实验室的关彝教授、广西医科大学的胡彦领教授团队，以及华南农业大学的沈永义教授和广东省现代农业科技实验室的肖丽华教授的两个研究团队，以前都曾在马来穿山甲中报告过与SARS-CoV-2相关的冠状病毒，它们被非法走私到广西和广东。

该研究小组提到，虽然在这些穿山甲中检测到的冠状病毒和非典病毒-CoV-2之间的距离在整个基因组水平上比大鼠13和非典病毒-CoV-2之间的距离长得多，但是它们在S蛋白的受体结合域(RBD)上与非典病毒-CoV-2非常相似。

因此，尽管目前还不清楚穿山甲是否是SARS-CoV-2向人类传播过程中的中间宿主，但它们可能在冠状病毒的生态和进化中发挥重要作用。

他们认为在穿山甲鳞片中发现的这些病毒可以表明在野生动物中仍然有大量的冠状病毒样本，其中一些可能直接参与了非典-CoV-2的出现。

一种新的蝙蝠源冠状病毒RmYN02

文章提到，2019年5月至10月，研究小组在云南省勐腊县采集了227只蝙蝠的302个样本。这些蝙蝠属于20个不同的物种。大部分样本来自马来菊头蝠(n = 48，21.1%)、河马幼体(n = 41，18.1%)和斯氏菊头蝠(n=39，17.2%)。样本来自多种组织，包括翼状胬肉(219)、肺(2)、肝(3)和粪便(78)。

除3只蝙蝠外，所有蝙蝠在活着的时候都被取样并释放。

利用新一代的宏基因组测序技术，研究小组首先确定了两个初步相同的序列。这些序列产生的样本来自2019年5月6日至7月30日的11份马来菊头蝠粪便。经过一系列的验证步骤，研究小组获得了部分(23395bp)和完整(29671bp)的蝙蝠冠状病毒基因组序列，分别命名为贝塔COV/RM/Yunan/YN01/2019 (RMYN01)和贝塔COV/RM/Yunan/YN02/2019 (RMYN02)。

相比之下，RmYN02与SARS-CoV-2密切相关，显示93.3%的核苷酸序列一致性，但在全长基因组水平上，鼠13和SARS-CoV-2具有更高的一致性(96.1%)。在大多数基因组区域(如1ab、3a、e、6、7a、n和10)，RmYN02和SARS-CoV-2非常相似(> 96%序列同一性)。特别是，在最长的编码基因区域1ab (n=21285)中，RmYN02与非典-CoV-2的同源性为97.2%。

然而，在s基因中RmYN02和SARS-CoV-2的序列一致性(核苷酸71.8%，氨基酸72.9%)远低于鼠13和SARS-CoV-2之间的97.4%。值得注意的是，在RmYN02和SARS-CoV-2之间的氨基酸同源性仅为62.4%。广东穿山甲冠状病毒与RBD SARS-CoV-2的氨基酸同源性为97.4%，也是RBD地区最接近SARS-CoV-2的氨基酸。

围绕非典型肺炎冠状病毒-2的同源模型、体外实验和S蛋白的三维结构分析结果均表明，非典型肺炎冠状病毒-2与非典型肺炎冠状病毒一样，也可以利用乙酰乙酸作为细胞受体。该研究小组还使用同源性模型分析了RmYN02、RaTG13和两只穿山甲的RBD。

研究发现RmYN02 RBD中的氨基酸缺失在受体结合位点附近形成两个比非典-CoV-2 RBD更短的环。重要的是，在RmYN02中，在非典型肺炎-CoV、非典型肺炎-CoV-2、鼠13、穿山甲/MP789/2019、穿山甲/GX/P5L/2017的外部子域中的保守二硫键被删除。研究小组推测，这些缺失可能导致构象变化，从而减少RmYN02 RBD与ACE2的结合，甚至导致不结合。

当然，也有可能环缺失的非典相关冠状病毒，包括RmYN02、ZXC21和ZC45，使用了一种我们目前还不知道的受体。

值得一提的是，先前的研究表明，RBD的六个氨基酸残基(L455、F486、Q493、S494、N501和Y505)是决定非典型肺炎冠状病毒-2型与乙酰乙酸受体结合的主要因素。与同源性建模一致，穿山甲/MP789/2019在所有6个位置都具有与非典-CoV-2相同的氨基酸残基。相比之下，鼠13、鼠mYN02和鼠mYN01在仅一个位置具有与SARS-CoV-2相同的氨基酸残基。

研究小组认为这种进化模式是重组和自然选择的复杂结合。

该研究小组还对蝙蝠冠状病毒在RmYN02、RaTG13、SARS-CoV-2和穿山甲鳞片中的系统发育进行了分析。与以前的研究一致，穿山甲β-CoVs形成两种亚型。然而，该论文提到穿山甲是否是这些病毒的天然宿主，或者它们是否是从蝙蝠或其他野生动物中独立获得的，需要进一步验证。

更值得注意的是，尽管两种病毒之间仍有很长的分支距离，但RmYN02和SARS-CoV-2在大多数病毒基因组中是密切相关的。S基因树显示，与RmYN02相比，非典-CoV-2更接近于鼠13，这表明后者在S基因中经历了重组。在RBD的系统进化树中，SARS-CoV-2和穿山甲-CoV/GD与蝙蝠病毒关系最为密切，这再次表明重组发生了。最后，完整的依赖于核糖核酸的核糖核酸聚合酶基因(通常用于核糖核酸病毒系统发育分析)系统发育分析表明，RmYN02，鼠13和非典-CoV-2形成了一个完全不同于穿山甲病毒的亚组。

SARS-CoV-2是天然来源的，可以通过重组获得。

与禽流感病毒的血凝素蛋白相似，冠状病毒的S蛋白在功能上分为两个亚单位S1和S2。然而，在某些禽流感病毒亚型的剪切位点插入多碱基氨基酸被认为与增强致病性有关。

值得注意的是，SARS-CoV-2的特征之一是在S1和S2的交界处插入了一个四氨基酸，这在其他β冠状病毒的其他谱系中没有观察到。这种所谓的弗林酶切割位点的插入是非典病毒外壳蛋白-2所特有的，目前在所有检测到的非典病毒外壳蛋白-2序列中都发现了这种插入。

这一次，研究小组还发现，在RmYN02的S1和S2交界处插入了三个残基，他们认为这非常重要。“尽管由非典型肺炎-CoV-2插入的残基(以及由此产生的核苷酸)不同于rymn 02中的残基，但可以证明它们是独立的插入事件。它们在野生动物(蝙蝠)中的存在强烈表明它们是天然的，可以通过重组获得。”

因此，这些数据有力地表明了非典型肺炎冠状病毒-2的自然起源。

此外，研究小组再次确认，RmYN02的蝙蝠宿主是马来菊头蝠，其与从马来菊头蝠标本获得的序列(Genbank acceptance MK 900703)100%相同。

马来菊头蝠和中国菊头蝠都广泛分布于中国西南和东南亚。论文中提到，一般来说，这些蝙蝠不会长途迁徙，而且非常合群。它们很可能生活在同一个洞穴里，这可能会促进它们之间的病毒交换和重组。

值得注意的是，科学家在肛门拭子中发现了老鼠13，在粪便中发现了老鼠02。因此，对于蝙蝠来说，粪便是一种简单但可行的将病毒传播给其他动物的方法，尤其是那些能够利用洞穴环境的物种。