实时逆转录聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

1、RT-PCR作用

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

2、合成cDNA引物的选择

1.随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2.Oligo（dT）：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3‘端Poly（A）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly（A）RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3.特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

3、试剂准备

1.RMA提取试剂

2.第一链cDNA合成试剂盒

3.dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

4.TaqDNA聚合酶

4、操作步骤

1.总RNA的提取：见相关内容。

2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列试剂的混合物：

10×PCRbuffer2μl

25mMMgCl22μl

10mMdNTPmix1μl

0.1MDTT2μl

轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加热15min以终止反应。

（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

3.PCR：

（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：

第一链cDNA2μl

上游引物（10pM）2μl

下游引物（10pM）2μl

dNTP（2mM）4μl

10×PCRbuffer5μl

Taq酶（2u/μl）1μl

（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

5、注意事项

1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3.内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5.防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。