新技术助蛋白质转印法提速
在蛋白质印迹发明30多年后,这项技术仍然是获得特异性蛋白质可靠鉴定的关键。许多最近出现的产品使用各种方法来提高蛋白质印迹实验的重复性、灵敏度、定量和速度。
据信有三个人已经开发了蛋白质的蛋白质印迹方法,但其中只有一个是“蛋白质印迹”的名字。他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心鲍勃·诺温斯基实验室工作的尼尔·伯内特。“蛋白质印迹法”的命名意味着南方印迹法(1975年埃德温·南方发明的一种技术,使用胶水、尼龙膜和吸水纸来识别复杂个体的特定DNA序列)、北方印迹法(后来发明了一种类似的策略来识别核糖核酸)和西海岸的诺维斯基实验室。
伯内特的技术成就直到1981年才发表。他回忆说,审查者当时“特别”反对使用“蛋白质印迹”这个名称。然而,这个名字仍然被沿用,并且蛋白质印迹技术已经成为最广泛使用的免疫化学技术之一。
工作原理
蛋白质印迹的第一步包括通过凝胶电泳根据大小分离蛋白质,然后通过将膜置于胶上将蛋白质转移到膜上(通常是硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜),向膜上添加几片吸水纸,然后将堆叠物置于缓冲溶液中,因此蛋白质可以通过毛细管作用被拉到膜上。这也是所谓的湿法或沟槽转移法。
另外两种技术是干转移和半干转移,它们比传统的湿转移更快、更有规律,但对高分子量蛋白质效率较低。对于半干转移法,膜和胶被放置在被缓冲溶液浸泡的滤纸层之间,并且它们被夹在阴极和阳极之间,因此电流可以驱动蛋白质转移到膜。在这三种方法中,干转移最快,但转移效率也最低。
转移后,将膜置于稀释的蛋白质溶液中以阻断非特异性蛋白质结合。然后将膜与一级抗体一起孵育,洗脱,并与用信号检测探针标记的二级抗体一起孵育。
最后一步是检测,通常使用化学发光或荧光方法。在化学发光检测中,与酶交联的二级抗体可与检测抗原产生的光反应,并可被胶片或成像装置捕获。在荧光检测中,抗体探针由荧光基团标记。
荧光检测法的主要优点是可以同时检测多种蛋白质,信号更加一致。因此,与化学发光检测相比,它也更有利于定量研究。
许多制造western blot相关设备、软件和耗材的公司都在努力实现这些步骤的部分或全部自动化,希望让这个实验更简单、更有效。同时,在实验中增加了一些验证点,这样研究人员可以随时监控实验的进展,甚至重建整个过程。科学家们正在寻找的是高效率、鲁棒性和策略,以帮助他们避免浪费有价值和昂贵的抗体。
加速免疫检测过程
正如EMD Millipore公司“蛋白质印迹溶液”产品经理Michele Hatler所说,转移印刷、抗体孵育、样品装载和洗脱占蛋白质印迹实验时间的80%。
总部位于加州特梅库拉的SNAP公司推出的蛋白质检测系统,利用真空装置推动试剂通过膜,而不是仅仅依靠扩散,加速了整个过程。哈特勒说,这将把免疫测试的时间从4小时减少到30分钟。她解释道:“我们确实致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然遵循传统的步骤,只是增加了一个真空装置。”
哈特勒指出,2.0版于2012年9月发布,与之前的版本相比有几个优势。它可以使用中等大小的凝胶(8.5×13.5厘米)和微型凝胶(7.5×8.4厘米),而以前只能使用微型凝胶。
“这种设备非常便宜,易于操作,但它有效地提高了实验效率,节省了实验时间。”哈特勒说。
Bio-Rad的反式印迹涡轮蛋白转移系统是一个实验平台大小的仪器,可以提供快速有效的转移。由于采用了新的转移缓冲配方、特殊的过滤材料和增强的电流强度(由集成电源调节),该系统可在短短3分钟内完成转移,压印结果可与狭缝转移媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟,通常不能为高分子量蛋白质转移提供强有力的结果。
添加验证点以减轻担忧
western blotting的高失败率通常非常令人沮丧,尤其是如果你需要几天才能得到结果。“这是一项非常不稳定的技术,”博乐“西方印迹集团”的营销经理瑞安·肖特说当我们调查用户时,我们发现他们中的一半报告说使用这种技术的失败率至少为25%。"
肖特补充道:“几乎没有机会检查实验过程是否符合预期。因此焦虑产生了。我们引入了视觉验证点的概念,以增强信心和确定性。”
该公司的标准和Mini-PROTEAN无染料预制胶,使用其ChemiDoc MP胶成像系统,使研究人员能够快速观察其蛋白质是否正确装载在凝胶上,从而确认高质量的蛋白质转移,这便于决定是否进行下一步或重新开始。化学计量泵系统是为化学发光和多重荧光斑点成像技术而设计的,可以在装有ImageLab软件的个人计算机上运行。
加州大学戴维斯分校的助理教授奥尔德林·戈梅斯说,这些验证点“非常有用”,他在实验室里使用了该系统。“我们可以在不添加额外染料的情况下对这些无染料凝胶进行成像,并且我们可以快速判断凝胶上运行的样本是否有问题。我们也可以在蛋白质转移到膜上后对凝胶成像。如果任何一个步骤有问题,我们可以在此时停止实验过程。”
成像和软件改善量化
当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时,越来越多的宽范围无胶片凝胶记录成像系统开始出现在世界上。这些系统可用于化学发光印迹、荧光印迹或两者的成像和分析。许多公司开始努力使成像仪及其分析软件尽可能方便。许多公司已经提供了按键式图像捕捉系统,其大小适合在实验平台上操作。
Syngene公司于2012年4月推出了一款非常简洁的单键操作系统PXi,用于分析化学发光和荧光印迹。该系统基于该公司的G:BOX成像系统,并配有基因系统成像软件。
2012年10月,赛默飞舍科技公司推出了myECL成像仪,该成像仪使用紫外和可见光透射方法、专业过滤器和电荷耦合器件(CCD)摄影技术来捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白质和核酸凝胶。
CCD相机的灵敏度是x光胶片的两倍。据该公司称,该仪器的动态范围高达10倍。用户只需按下触摸屏上的一个最佳预设按钮,无需对焦或调整相机设置。用户还可以设置自定义曝光,可以同时设置最多5种不同的曝光,或者使用预设的曝光参数。该成像仪占用的仪器空间非常小,可以在实验平台上使用。
Aplegen的欧米茄Lum G凝胶记录系统还具有自动聚焦功能,可在实验平台上操作,并配有集成平板电脑。UVP公司于2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像仪,该成像仪集成了电脑和触摸屏,允许用户调整曝光、光圈、放大和缩小以及焦距等参数。当用户按下实时预览按钮时,他们也可以提供图像实例。
LI-COR的最新红外成像系统版本是Odyssey CLx,其动态范围超过6个对数,而之前的版本仅具有超过4个对数的动态范围。当分析蛋白质印迹结果时,这种增加的范围可以消除饱和,并提供可转换成定量数据的更宽的线性范围。
“不仅研究人员的照片不会达到饱和,而且他们还可以将多个打印结果输入成像仪,而不用担心对这些照片进行不同的设置和调整。”林肯内布拉斯加州高级产品营销经理杰夫·哈福德解释道。
瑞哈娜·里克是匹兹堡杜肯大学的助理教授。她使用LI-COR的奥德赛CLx系统来研究细胞如何适应低水平的压力。“奥德赛成像仪的优点是它是一个16位成像仪,有700和800纳米的两个红外波长,可以一次成像两个光点。”泄漏说,“这意味着我们可以一起检测磷酸化和构象蛋白质。”用其他方法很难同时区分这两种蛋白质亚型,因为它们的组非常相似。
泄漏指出,奥德赛成像仪可以显示216种深浅不同的红外信号,相比之下,x光胶片上显示的是150种深浅不同的灰色。"这将从150到65,000个红外阴影过渡,所以这种方法可以获得更高的分辨率."她补充道,“这是一个不寻常的量化。”
2012年12月,LI-COR宣布了一种新的数字成像系统,即C-DiGit系统,该系统可用于化学发光印迹。该系统将于2013年推出。“正如近年来数码相机已经取代了胶片相机一样,我们相信数码相机系统一定会取代胶片化学发光。”李-科尔的资深科学家乔恩·安德森说:“这项技术可以提供电影用户所习惯的所有灵敏度和图像质量,同时显著提高数字图像的质量。”
软件总是很直观
蛋白质印迹的传统软件分析要求用户将数据从图像导出到电子表格,而随后的均质化计算和分析是手动完成的。BioRad于2012年9月发布的图像实验室4.1软件为管家蛋白或总装载蛋白提供了嵌入式和自动化的均质化。
"这是我在市场上见过的最好的产品之一。"戈梅斯说,他正在研究蛋白酶体和肌钙蛋白在心脏和骨骼肌组织中的作用。"最好的事情是它是完全免费的。"戈麦斯补充说,图像实验室4.1软件比他以前在实验室使用的图像分析软件简单,几乎每个人都能掌握。"这确实增强了我们量化蛋白质的方法."
李-科尔还推出了一个新的成像软件,图像工作室,这可以用于其奥德赛系统。用户只需选择一个检测通道,然后按下一个按钮即可获得图像。新版软件提供毫米间隔分析,而不是厘米间隔分析,同时能够执行全自动和手动分析。
重建西方印迹
除了对传统的蛋白质印迹技术进行微调之外,蛋白质简单公司的简单蛋白质系统已经重新开发,整个过程已经通过毛细管电泳完全自动化。2011年,该公司推出了西蒙,并计划用该仪器取代蛋白质印迹。Simon可以根据大小进行分离、免疫检测、洗涤、化学发光检测和定量分析。科学家只需要添加样本,然后离开,再回来获得充分分析的数据。Simon甚至可以发出哔哔声通知用户结果出来了。
该公司在2012年初立即推出了莎莉,允许用户在一次实验中表演96个简单的西部片。最新的设备是佩吉在2012年9月推出的,它可以一次分析96个样本,并根据大小或电荷分离蛋白质。Simple Western克服了传统Western印迹法手工部分的缺陷,如缺乏重复性或定量结果。此外,多重检测已经成为传统蛋白质印迹的一个挑战。研究人员现在可以使用荧光来观察样品中的2或3种蛋白质,并且转移的设备可以同时运行8片微型胶或4片中型胶,但是这已经是传统的蛋白质印迹方法所能达到的极限。Simple Western可以对每个毛细管中的蛋白质进行多重分析,从而基本上消除了传统Western印迹方法的局限性。
对于斯坦福大学医学院的肿瘤学老师爱丽丝·范(Alice Fan)来说,简单西方技术最令人兴奋的地方是它分析微观样本的能力。
10多年来,范一直在收集患者的组织样本,她一直在等待一种工具,这种工具可以让她在不使用整个样本的情况下分析肿瘤细胞的蛋白质组。“我已经找了很多年了,希望有一种可以用很少量的组织进行蛋白质印迹的装置。”她解释道。
除了帮助她保存之前储存的组织外,莎莉还允许范使用细针抽吸法多次从患者体内提取一些样本,而不是进行全面的活组织检查。范希望这能帮助她实时观察患者肿瘤对药物的反应。“在描述不同类型的肿瘤时,这确实对我的研究大有裨益。这是巨大的进步。”
默克公司疫苗生物化学团队的负责人理查德·鲁斯坦迪在2011年底购买了一台西蒙仪器。当时,他并没有很高的期望。但是,他说,他得到了一个意想不到的惊喜。“这仪器太棒了。几个月后,我们又买了一个。”
根据鲁斯坦迪的说法,尽管西蒙并不完美,但它可以被真正量化。他接着说,手工蛋白质印迹的变异率通常为35%至45%,但他和他的实验室可以将西蒙的变异率控制在10%以下。
随着蛋白质印迹技术的不断发展,研究人员不必像保姆一样花很多时间观察他们的实验。“他们的时间非常重要。”简单西方公司的产品经理彼得·冯(Peter Fung)认为,“你用的时间越多,你能做的研究就越好。”
(高大海,翻译之一,中国科学院海洋研究所助理研究员
安妮·哈丁是纽约附近的*作家。DOI:10.1126/science . opms . p 1300073
致谢:“原文由美国科学促进协会(www.aaas.org)于2013年3月1日在《科学》杂志上发表。)
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