基因编辑器CRISPR让突变小鼠触手可得
鲁道夫·耶尼斯在1974年培育了第一只转基因小鼠,并首次证明了CRISPR在生产基因敲除小鼠方面的能力。资料来源:肯·理查森
2013年初,迈克尔·怀尔斯与缅因州杰克逊实验室的最高管理层坐在一起,告诉他们一种具有惊人力量的新的脱氧核糖核酸切割方法。这个实验室,简称JAX,使用基因工程技术,用JAXR老鼠作为注册商标改造老鼠,并卖给研究人员。它喜欢吹嘘自己是“世界上质量最好、发表最多的鼠标模型”。Wiles为实验室评估和开发新技术。他相信,这种新工具,巧妙地从细菌和古细菌用来保护自己免受病毒侵害的免疫策略中改造而来,将彻底改变JAX改造老鼠的方式。"在场的十几个人中,有九个睡着了。"怀尔斯说,“当时没人听说过克里斯普。”
今天,绝大多数老鼠饲养者都知道CRISPR。长期以来,JAX和其他培育新小鼠品系的实验室一直依赖于一个费力的多步骤过程,包括使用基因工程技术来改变小鼠胚胎干细胞,将它们注入胚胎,并培养几代小鼠。即使是JAX最好的团队也需要2年时间来成功改造一只老鼠。CRISPR用一种可以对受精卵进行靶向基因手术的分子复合物取代了这一切。它能在6个月内生产出一只改良过的老鼠。
基因被敲除或通过基因改造增加基因信息的小鼠已经成为一系列人类疾病的关键研究模型,这些疾病包括癌症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、骨关节炎、肌肉萎缩症和帕金森氏病。基因敲除和敲除小鼠也为研究特定基因的功能提供了强有力的工具。
"当你过去培育基因敲除小鼠时,你需要一些技巧."麻省理工学院的Rudolf Jaenisch说,“现在,你不再需要这些技能了。”任何傻瓜都能做这件事。"
有很大影响
CRISPR代表“聚集的、规则间隔的短回文重复序列”。它来源于原核遗传物质,是后者的描述。CRISPR使用导向核糖核酸将生物“剪刀”(通常是与CRISPR-cas9相关的蛋白质)转移到基因组中的精确位置。一旦Cas9被酶解剪切,细胞将试图修复受损的DNA。一种修复机制导致基因敲除,而另一种机制导致基因敲除。"克里斯普所做的只是切割DNA . "怀尔斯说,“其他事情是由细胞修复系统完成的。这是我们可以搭便车的地方。”
细胞的标准反应是试图在断点处拼接双链DNA。这通常需要吞噬或添加一些碱基,导致基因插入或缺失。事实上,这种修复努力会在DNA文本中引入一些小的“排印错误”,从而使基因失效。
Jaenisch第一次证明了CRISPR在生产基因敲除小鼠方面的能力。在研究人员首次证实CRISPR在哺乳动物细胞中起作用五个月后,Jaenisch及其同事在2013年5月的《细胞》杂志上发表了一篇论文。他们报告说,这项技术成功地从一组小鼠胚胎干细胞中分离出五个基因,这在以前是不可能的。更重要的是,他们证明了他们可以完全绕过胚胎干细胞,从单细胞小鼠的受精卵中敲除两个基因。研究人员不再需要修饰胚胎干细胞,也不需要费力地培养几代小鼠,来生产在卵细胞或精子细胞中有基因突变的小鼠。与此同时,如果研究人员想培养具有两种突变的小鼠,他们就不再需要杂交单一的突变株,并经历类似的耗时且繁琐的过程来获得生殖细胞系发生改变的小鼠的后代。
从那以后,500多篇论文详细描述了CRISPR是如何敲入和敲入小鼠基因的。“它的影响是巨大的。”1974年培育出第一只转基因小鼠的耶尼斯说。加拿大多伦多大学的生物化学家Takamak认为,这项技术确实改变了获取这些转基因动物的时间和效率。根据Mak的估计,与使用胚胎干细胞相比,使用CRISPR转化小鼠的成本要低30%左右,从而大大降低了他的平均成本。
它不仅节省了成本
CRISPR的影响不能仅通过成本节约来衡量。这项技术的便利性和快速性使得快速转化小鼠成为可能,从而解决了多伦多儿童医院的许冠中最近面临的一个特殊问题:在基因敲除过程中,缺失的基因没有产生可观察到的效果。惠意识到被敲除的基因与另一个可能补偿它的基因有关。他向在多伦多表型基因组学中心监督老鼠繁殖的月桂基纳特求助。纳特使用CRISPR从最初的基因敲除过程中突变受精卵中的干扰基因。“我们得到了受精卵,并注射了CRISPR-Cas9。8周后,回获得了双突变体纳特说,“如果使用胚胎干细胞,可能需要几年才能完成。”
这场革命并不局限于培育具有生殖细胞系突变的小鼠。CRISPR还允许研究人员在成年小鼠体细胞中同时突变几个可疑的癌症基因。同时,CRISPR基因敲入可以纠正导致成年小鼠疾病的基因缺陷,如导致血友病和镰状细胞贫血的突变。几个研究小组计划将CRISPR注射到发育中的小鼠体内,目的是创造可以充当条形码的突变,并使科学家能够在细胞分化时追踪细胞谱系。
像多伦多表型基因组学中心和JAX这样的老鼠育种公司希望CRISPR能大大扩大它们产生的突变范围。"现在,我可以得到一只有3个基因修饰的不寻常的老鼠,并且可以再次修饰它."怀尔斯说,“我们不能用胚胎干细胞进行持续的基因改造。我们可以将一只经过两次基因修饰的小鼠与另一只经过两次基因修饰的小鼠杂交,但要获得所有四次基因修饰需要几年时间。”
刚刚开始
然而,在某些方面,CRISPR的革命正在动摇。在杰尼斯奇的实验室首次报道CRISPR三个月后,他和他的同事在发表在《细胞》杂志上的第二篇论文中提出,CRISPR可以很容易地进行更复杂的基因手术,即敲入DNA片段,而不是简单地使基因失效。例如,他们用CRISPR将荧光标记敲入小鼠受精卵。当一个特定的基因被开启时,荧光标记就会亮起。研究人员还创造了对许多研究至关重要的条件突变体。
大约1/3的小鼠基因对胚胎发育至关重要。如果这些基因从一开始就被禁用,老鼠就不会出生。因此,科学家利用胚胎干细胞进行研究,巧妙地设计了一种叫做Cre-Lox重组的系统。只有在老鼠发育到足以在失去上述基因后存活下来后,这个系统才会剔除基因。这需要在靶基因和Cre基因的两侧增加额外的DNA: Lox位点。Cre基因可以被激活,产生一种酶,用于修饰Lox位点之间的DNA。Jaenisch的团队使用CRISPR将相同的系统插入受精卵,并报告说条件小鼠繁殖效率相对较高,大约16%的受精卵产生了突变正确的小鼠幼崽。
尽管在英国韦尔科姆基金会桑格研究所领导一个团队开发突变小鼠胚胎干细胞的威廉·斯卡尔尼斯是许多研究人员中对耶尼斯奇的初步报告印象深刻的一员,但当他试图将这项技术引入实验室时,他感到失望。“从他的论文来看,这项技术非常简单。我非常有信心,这将消除胚胎干细胞。”斯卡内斯说,“但令人失望的是,我们中没有一个人能复制杰尼斯报告的效率。在JAX实验室,只有1%或2%的受精卵产生正确突变的老鼠幼崽。与此同时,许多项目正走向失败。显然,这并没有被证明是一种稳健的方法。”
不管CRISPR目前有什么缺点,Wiles强调它在改造老鼠方面的潜力不应该被忽视。" CRISPR可以做很多事情,我们才刚刚开始."(宗华编译)
中国科学新闻(2016-121,第三版国际)
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