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火箭免疫电泳

科普小知识2022-09-27 10:24:04
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火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIEP)是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。

1、实验原理

电泳时,含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动,而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时,形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰,峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此,当琼脂中抗体浓度固定时,以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标,抗原浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量;反之,当琼脂中抗原浓度固定时,便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。

2、实验材料

(一)材料和试剂

1、PH8.6,0.1M巴比妥--巴比妥钠缓冲液

巴比妥钠10.3g

巴比妥1.84g

硫柳汞100mg(防腐剂)

蒸馏水加热溶解并定容至500ml

2、1%预复琼脂(或琼脂糖)

1g琼脂(或琼脂糖)加蒸馏水100ml溶化即可。

3、1.5%琼脂糖凝胶

1.5g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解(注意不要溢出且注意加入蒸发的水),然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀,置4℃保存备用。

4、抗原及相应免疫血清。

(二)设备和器材

玻璃板、模具,打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒(内铺有湿润的滤纸)、温箱(25℃)、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。

3、操作步骤

1、抗原、抗体浓度的选择

以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法,选取最小抗原量与最低抗体浓度,在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰,长达2——5cm者为标准。一般抗原用量为0.5——5微克,抗血清用量为5——10微升,稀释度于1:10——1:200之间进行选择。

2、预复琼脂玻板的制备

将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将表面覆盖即可,放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。

3、抗血清琼脂板制备

根据上述选择结果,取一定量抗血清与一定量融化并冷却至56℃的1.5%巴比妥缓冲琼脂混合,使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度,浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为1——2mm,玻板大小可根据实验所需而确定。如用5×7.5cm大小玻板时,约需抗血清琼脂6ml.

4、打孔、加样

待琼脂凝固后,于距玻板一长边10mm处,以3mm孔径打孔器打孔一排,孔距5mm.于各孔中加入抗原液,每孔10微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。

5、电泳

将琼脂板置于电泳槽横梁上,加样端位于负极,以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液(槽内缓冲液为0.06MpH8.6巴比妥缓冲液)。接通电源,板端电压3v/cm,电流强度3mA/cm,电泳5小时。

6、结果判定(电泳结果示意图点击展开)

电泳毕,取出琼脂板,依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后,加1%鞣酸冲洗琼脂板,晾干,即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种:一是测量沉淀峰的高度(自孔*至峰尖),以mm计;另一是以求积仪测量沉淀峰的面积,以mm2计。前者较简便,后者较准确。根据测定的结果,从标准曲线中计算出待检标本中的抗原含量。

7、标准曲线制定

用上述选择好的最适浓度抗血清制备琼脂板。打孔,加入合适比例的5——10个标准抗原浓度,反复试验10次,取每次电泳后所测定的沉淀峰高度(或面积)的平均值,绘出标准曲线。

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