基因测序

基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，如癌症或白血病。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用，目前在众多保健及医疗机构和体检中心，都打出基因测序的广告，但其使用的基因测序仪及相关诊断试剂和软件，很多没有经过医疗器械的注册审批。对此，国务院有关部门高度重视。2014年2月，中国国家食药监管总局、国家卫计委联合发出通知，要求在相关准入标准、管理规范出台以前，任何医疗机构不得开展基因测序临床应用；已经开展的，要立即停止。2014年7月2日，国家食品药品监督管理总局首次批准二代基因测序诊断产品可用于孕妇产检。

1、概述

基因测序是对目标DNA进行碱基的序列测定，并进行各种相关分析。是现代生物学的重要手段之一，同时也是生物学迅猛发展的重要动力。它推动了生物学的发展，它促使生物学从DNA水平上进行各种研究。

基因（Gene,Mendelianfactor）是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。基因有控制遗传性状和活性调节的功能。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，并通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物的个体性状表现。基因还可以通过控制结构蛋白的成分，直接控制生物性状。因此对生物从分子生物学水平上进行研究，在医学上对某种遗传疾病的研究等都离不开对DNA或RNA的序列进行测定。基因测序也成为生物学研究的重要手段。

在基础生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。应用最广泛的是由弗雷德里克·桑格发明的Sanger双脱氧链终止法（ChainTerminationMethod）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。

2、原理

基因就是DNA大分子的一个片断。核酸分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）两类，它们共同执掌着细胞的新陈代谢，核酸作为生命的根源是遗传因子的本体，能完全控制细胞的分裂、成长与能量的产生。

现代遗传学家认为，基因是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因位于染色体上，并在染色体上呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达。不同人种之间头发、肤色、眼睛、鼻子等不同，是基因差异所致。

由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。

在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

3、测序方法

Sanger测序法

Sanger（桑格）双脱氧链终止法是FrederickSanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DN******段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DN******段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。

Maxam－GilbertDNA化学降解法

在这一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一个末端标记的DN******段在5组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成5组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。这一方法的成败，完全取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。第一步先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰，而第二步修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5'和3'的磷酸二酯链断裂在每种情况下，这些反应都要在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5'和3'位置，得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A＋G、C＋T、C和A>C各个泳道，右从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。

霰弹枪定序法

霰弹枪定序法（Shotgunsequencing，又称鸟枪法）是一种广泛使用的为长DNA测序的方法，比传统的定序法快速，但精确度较差。曾经使用于塞雷拉基因组（CeleraGenomics）公司所主持的人类基因组计划。

4、应用

测序应用（genesequence）

对目标DNA进行碱基的序列测定，并在此基础上，进行各种相关分析。

片段分析应用(genescan）

在测序仪上走一个荧光标记的高精度电泳，通过条带和分子量标准比较，判定分子量，并进行相关分析。医学测序（基因突变、缺失等与疾病的关系等），细菌、真菌鉴定（16SrRNA、D2rDNA测序），杂合子、突变检测（SNP检测、微生物基因变异等），基因进化分析（微生物溯源研究等）。

疾病诊断

1996年，一对双胞胎出生了，男孩叫诺亚，女孩叫艾丽西斯。然而，他们的行为举止与别的孩子有所不同。从回到家的那天起，这对双胞胎就开始腹痛，并且一天要呕吐好几次。在孩子们两岁的时候，他们被确诊为脑瘫。在精心的治疗和护理之下，这对双胞胎的病情似乎得到了控制。然而，5岁半的时候，双胞胎的病情又开始恶化。女孩艾丽西斯的眼珠开始上翻，手也无法正常下垂；男孩诺亚则是一天24小时地不断呕吐。他们甚至无法像正常人一样走路、说话。此后，双胞胎的病情又几次反复，一直没有找到能治愈他们的方法。

2003年，机缘巧合，这对双胞胎和他们的哥哥以及父母进行了一次基因测序。经过对比分析，最终发现双胞胎致病的罪魁祸首是体内一种还原酶发生了基因突变。它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质的细胞途径。找到病因后，医生立刻做出了精确的治疗方案。一个月后，这对双胞胎被治愈。让这对双胞胎重获健康的，便是来自于生命技术公司的基因测序技术。

体检

基因测序，本是一种实验室研究技术手段，因“名人效应”应用于高端体检、产前诊断等领域，价格不菲。基因测序最广为人知的，是影星安吉丽娜·朱莉通过基因检测，选择手术切除乳腺以降低患乳腺癌风险。2011年去世的苹果公司创始人史蒂夫·乔布斯患癌时，曾经花费10万美元将他的癌肿瘤和正常的DNA进行测序。

5、问题

基因测序虽然是一种很好的治疗手段，但是中国科学院北京基因组研究所教授甄二真表示，目前从应用的角度来说，科学家只确定了极少数的基因位点与极少疾病的确切关系，也就是说真正可以用于临床诊断和指导治疗的基因检测并不多。要想真正用基因来诊病，还需要时间。

基因测序就像一把双刃剑，如果运用得不得法，它也有消极的一面。若全基因的检测普及，含有基因缺陷的人的信息，一旦落入保险公司或者被测者雇主的手中，将对他的生活产生不良影响。

而且基因测序并不是个性化治疗的唯一基础，其他还包括基因治疗等其他技术基础。另外，目前确定疾病基因位点的方法很多，相对于测序技术及也有很多同样便宜和快捷的。更重要的是，对于任何基因测序的设备来说，用于临床前必须对其可靠性和可重复性做好完备的临床试验，并且取得FDA和SFDA的权威认证。

6、规定

官方叫停

2014年2月17日晚，国家食品药品监督管理总局相关负责人坦言，基因测序的临床应用多出现于医疗机构和体检中心的高端体检，但其使用的基因测序仪及相关诊断试剂和软件，很多没有经过医疗器械的注册审批。对于突然叫停的原因，这是通知里最接近答案的一句话：“基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床应用，其中涉及到伦理、隐私和人类遗传资源保护、生物安全以及医疗机构开展基因诊断服务技术管理、价格、质量监管等问题。”

首次获批

2014年7月2日从国家食药监总局获悉：国家食药监总局经审查，日前批准了BGISEQ—1000基因测序仪、BGISEQ—100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定连接测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。

该批产品可通过对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序，对胎儿染色体非整倍体疾病21—三体综合征、18—三体综合征和13—三体综合征进行无创产前检查和辅助诊断。

据悉，2014年2月份，国家食药监总局、国家卫计委曾联合下发通知，要求加强对基因测序的管理，按照规定，“包括产前基因检测在内的所有医疗技术需要应用的检测仪器、诊断试剂和相关医用软件等产品，如用于疾病的预防、诊断、监护、治疗监测、健康状态评价和遗传性疾病的预测，需经食品药品监管部门审批注册，并经卫生计生行政部门批准技术准入方可应用。已经应用的，必须立即停止。”

“大数据+基因测序”全球肿瘤专家天津谈癌症

2016年8月19日，由天津医科大学肿瘤医院主办的第二届肿瘤转化医学国际研讨会在津召开，来自美国、英国、瑞典、日本、韩国等国家的全球肿瘤医学专家齐聚一堂，共同探讨癌症防治的最新动态。据世界卫生组织发布的全球癌症报告显示，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，到2035年，将可能达到2400万人，20年时间将增加近五成。目前，肿瘤的治疗模式仍然是“一刀切”，不同的人患上同一种病都是同一个治疗方案。这种治疗模式忽视了人类自身遗传基因差异性的重要因素。而基于大数据分析、以基因测序为主的精准医疗，可以监测人的遗传信息，为肿瘤的早期预防、早期筛查、早期诊断和药物研发提供重要依据，并为肿瘤精准医学的实施奠定基础，这将有可能改变目前肿瘤治疗过程中传统“一刀切”的治疗模式，可以针对不同的人提供定制个性化治疗方案，提升治疗效果。