13个课题组实名声明：无法重复韩春雨实验

"现在有些科学家一再未能向我们展示他们的真名。"“那就让他们用真名吧。如果他们愿意使用真名，我们将让那些成功重复实验的人使用他们的真名。”这是《科技日报》最近(2016年10月10日)的一篇报道，引起了很多关注。

同一天，中国科学院、北京大学、浙江大学、上海交通大学、华东师范大学、哈尔滨工业大学、温州医科大学等科研院所的13名科研团队负责人公开表示，他们不能重复韩春雨今年5月2日在《自然生物技术》上发表的NgAgo实验。这些科学家表示，这一说法是为了提醒韩春雨和河北科技大学，作为同行，每个人都在认真重复实验和验证技术，以免因误解而做出的负面判断会影响新技术的发展。然而，作为科学界的一员，韩春雨也应该尽快认真回应当前的科学质疑，并履行其作为论文交流作者的责任和义务。

十三个研究小组同时发表声明。

这次愿意站出来发表公开声明的13位学者是:北京大学生命科学学院的危文胜教授；北京大学生命科学学院研究员孙玉杰；北京大学分子医学研究所熊经纬教授；中国科学院动物研究所研究员王皓毅、李伟；中国科学院生物物理研究所研究员王小群；中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员李劲松。杨辉，中国科学院上海科学院神经科学研究所研究员；王黎明，浙江大学生命科学研究所教授；吴强，上海交通大学教授；李大力，华东师范大学生命科学学院研究员；哈尔滨工业大学教授黄志玮；和温州医科大学教授谷峰。

“我们不能再拖延了。我们必须畅所欲言，让国际科学界看到中国科学家在我们领域的态度(即基因编辑)。”这是13位学者的共同态度。

危文胜说，在过去的几个月里，他的实验室里有四五个学生根据韩春雨论文中提到的实验方法做了许多不同的尝试，但是实验结果没有发现基因组序列有任何变化，也就是说，“实验方法不能反复验证”。

中国科学院动物研究所的研究员王皓毅在他的实验中获得了类似的结果。对于韩春雨文章中的“三个效率更高的gDNA”，他的两个学生独立编辑了内源基因，但没有一个能检测到目标基因的突变。王皓毅说:“我们也尝试过两次转染gDNA并延长培养时间，但没有阳性结果。”

这可以说是最常见的经历。吴强说，他们用聚合酶链反应检测脱氧核糖核酸片段缺失，这应该是检测，只要体内的脱氧核糖核酸片段被编辑，即使效率很低，但即使是这样也不是。李劲松说，一些同事甚至分析了NgAgo的结构，试图找到它的功能位置，但结果并不像预期的那样。

王黎明说，尽管有各种各样的失败，这仍然只是一个学术争议。无论发生在中国、美国还是日本，都应该有标准的学术规则来处理。

谁有权利和责任调查挑战？

今年5月2日，《自然生物技术》发表了韩春雨的论文《使用NgAgo的基因编辑技术》，声称这是一种新的基因编辑工具，比目前实验室最流行的基因编辑工具CRISPR-Cas9更有优势。该论文发表后，立即引起了全世界同行的广泛关注。许多国内同事已经联系了韩春雨，希望重复和跟进他的工作。然而，不久之后，各种无法重复的疑问开始聚集，并最终引起了自然生物技术的注意。发布了一份声明，要求韩春雨研究小组“及时向读者提供材料、数据、代码和相关实验程序，不得有不当限制”。

河北科技大学在8月3日接受《人民日报》采访时承诺，在一个月内，韩春雨将采取适当的公开核查形式，并有权威的第三方作证。然而，到目前为止，《自然生物技术》还没有进一步评论，一位杂志发言人说，调查仍在继续。

这是怎么回事？一家著名国际学术期刊的主编告诉作者，事实上，学术期刊通常没有权力、能力或兴趣去调查科学家的科研成果，除非论文受到同行的高度质疑。例如，一些杂志会委托第三方来重复，而更多的杂志会让科研机构自己处理。

“事实上，真正有责任和权力调查结果的是作者所在的单位和为项目提供资金的出资人。”他说，世界上的普遍做法是，当某项成就引起巨大争议时，首先考虑解决科学问题。一般来说，作者工作的科研机构或赞助者将指定几个在该领域具有高度公众信任的研究小组来重复实验。在这个过程中，被提问的研究小组应该配合并指导实验的完成。如果他们不合作，他们必须接受调查。如果指定的研究小组重复这个实验，同伴们会认可这个成就并继续向前推进。如果不能重复，至少要科学地向同事发出明确的信号，以避免不必要的投入——至于原因，让机构和赞助人仔细调查并妥善处理。

“这样做是必要的，否则会浪费更多纳税人的钱。上海交通大学系统生物医学研究所教授吴强说，重复实验需要资金。如果韩春雨能更早地解开他的同行的谜团，那也能减少国家宝贵的科研经费的浪费。

浙江大学生命科学研究所的王黎明教授在他的个人微信公众号上发表了一篇题为《关于基于NgAgo的基因编辑技术的个人声明》的文章，他在文章中指出，国家自然科学基金委、河北省发展和改革委员会等为韩教授的研究提供资金支持的监管机构，以及韩教授工作的河北科技大学，应该进行客观、全面的调查，以检查是否存在学术错误甚至不当行为。在这方面，日本的RIKEN的态度可以在著名的STAP干细胞欺诈案中借鉴。在这种情况下，面对国际同行不能重复他们实验结果的疑虑，为方工作的论文主要作者RIKEN，在几周内迅速开始了调查。在发现对他的博士论文和实验记录的怀疑后，他立即宣布撤回他的学术论文，有效地消除了不利影响。从那以后，RIKEN进行了耐心细致的调查，包括安排Kohokata在摄像机的监督下重复实验，以及使用基因测序方法来验证他论文中使用的实验材料。最后，Riken得出了学术不端行为的结论，并严肃处理了相关责任人。事实上，只有这样深入而全面的调查才能最终明确韩教授的姓名，或者最终确认韩教授的研究是错误的甚至是不当的。事实上，发现真相、解决问题的过程不仅不会损害相关机构的声誉，还能更好地净化学术环境，维护学术界的信誉。

值得注意的是，在河北科技大学网站近日公布的“万人计划”候选人名单中，韩春雨被推荐为“中青年科技创新带头人”。

呼吁公布成功重复实验清单

当我第一次看到韩春雨的论文时，王黎明非常高兴和兴奋。他的实验室很快要求得到这些材料，并想把它们扩展到他自己的研究中。但在接下来的两个月里，他们相继测试了多达数百个实验条件，并根据韩春雨的最新方法进行了重复实验，但没有人观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。

在上述陈述中，他提出，从逻辑上讲，NgAgo在果蝇胚胎中没有基因编辑活性，这不能证明NgAgo方法是错误的，更不用说简单地推断韩教授的团队有学术不端行为。因为严格地说，他的研究小组正试图在新系统中推广NgAgo方法的应用，而不是简单地重复韩国论文的结果。更重要的是，判断学术错误甚至学术不端需要更详细的信息和调查。然而，尽管如此，由于科学研究成果是公开的，它们必须保证是真实的和可重复的，公司的技术秘密可以保密。然而，公开发表的学术成就不能被同行顺利地重复。它不仅毫无价值，而且动摇了整个学术界的生存基础——默认情况下，对方是诚实的，对方的研究成果是真实和正确的。

中国科学院上海科学院生物化学与细胞研究所的研究员李劲松也表达了同样的观点。他的研究小组也绞尽脑汁，考虑各种情况来重复实验，但没有得到积极的结果。如果每一项成果只有在经过自身验证后才能被接受，那么整个科学研究系统的效率将是不可容忍的。“科学研究天生是容错的，但当问题出现时，我们可以一起讨论和探索，以提高科学研究的整体效率。”他说，许多国际同行不再关注NgAgo技术——不要浪费资源，要么等待一篇系统地否认该技术的论文出现，要么等待某人确认该技术可行。

然而，由于韩春雨没有给出令人满意的答复，许多学者报告说，在过去两三个月里，一些著名学术期刊要求中国科学家提供最原始实验数据的事件变得更加频繁。与RIKEN对小鲍方·青子的严格调查相比，河北科技大学对韩春雨的信任给予的原则更少:即使同行提问也可以充耳不闻——世界同行会如何看待中国的科研诚信？

中国科学院院士、北京生命科学研究所副所长邵峰认为，这本来是学术界最常见的事情，现在已经有了一个非常成熟的解决办法。由于处理不当，没有必要引起更多的波浪。

基于上述原因，业界呼吁韩春雨公布一份成功重复实验的名单，让事件可以回到简单和纯粹的学术讨论。

附件:公开宣布目前不能重复实验的一些研究小组的名单

1.北京大学生命科学学院危文胜课题组

我们利用文章中报道的高效ssDNA，设计了另外两个针对体内其他基因位点的ssDNA，并将HEK293T细胞和HeLa细胞与NgAgo表达质粒一起转移。2天和5天后，T7E1用于检测切割效率。在HEK293T和HeLa细胞系中，无论是一次转染还是8-12小时后的另一次转染，均未检测到针对两种不同基因的这三种ssDNA的切割。

对于基因敲除后能改变细胞表型的特定基因，我们设计了ssDNA并将其与NgAgo表达质粒一起转移到HeLa细胞中5天，发现细胞显示出一定的对应表型。然而，我们收集这些细胞来提取基因组，对目标位点进行测序，发现基因组序列没有变化。

我们为一个特定的基因设计了6种ssDNA，并使用特定的荧光报告系统来检测是否产生了目标DSB。结果表明，所有实验组都没有检测到靶位点处的DNA序列的切割活性。

2.中国科学院动物研究所王皓毅研究组

我们在293T细胞中表达带有标志标签的NgAgo，并检测不同时间点的NgAgo蛋白表达。发现转染后6小时检测到靶蛋白，并且蛋白的量随时间增加。在人类293T细胞系中，重复原始文章中图4b中DYRK1A和GATA4上的NgAgo的基因编辑，并使用文章中公布的指导DNA (gDNA)。具体的实验方法是将NgAgo和相应的gDNA分别共转染到细胞中，分别在6小时和12小时后再转染相应的gDNA。转染后3-4天收集细胞用于调查。在靶位点没有检测到靶带的切割，测序中也没有发现突变。结果没有重复图4b。

我们还用原始文章中的图3进行了切割绿色荧光蛋白质粒的实验。使用文章中的eGFP gDNA G3，转染2天后，观察荧光表达并进行流动检测。NgAgo+gDNA G3，NgAgo+gDNA靶向其他位点，pUC19+G3，pUC19+5’末端没有磷酸化修饰的gDNA，并且单独转染gDNA可以显著降低eFP的表达。对于质粒靶位点的基因分型(调查、聚合酶链反应和测序)，没有检测到突变。结果没有重复图3。

我们使用的细胞定期进行支原体检测，没有发现细胞污染。

3.中国科学院上海科学院生物化学与细胞研究所李劲松课题组

我们主要做了两个实验:一个是将NgAgo基因和gDNA注射到八月四日EGFP小鼠受精卵中，并尝试不同的浓度组合。在胚泡期，也有弱光或弱发光的情况，但测序显示序列没有突变；另一个是在细胞水平。我们最初将NgAgo和gDNA载体共转移到Oct4-EGFP的单倍体细胞中。分选的双阳性细胞直接测序或培养后测序，无突变。我们开始怀疑NgAgo的表达窗口相对狭窄，因此我们对载体进行了修饰，建立了稳定表达Ago的细胞系，并且仍然没有突变。之后，我们完全按照NBT文章中的实验，在293T细胞中靶向hDYRK1基因。gDNA的长度和位置与文章中相同，但仍无突变。

4.浙江大学陈述科学研究所王黎明课题组

我们的实验室在韩春雨论文发表后一周内获得了恩加戈的DNA载体，并立即计划测试恩加戈的方法。在长达两个月的数百个实验中，在我们测试的所有条件下，我们没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。

5.北京大学生命科学学院孙玉杰课题组

我们使用来源于原始细菌并经人工合成密码子优化的NgAgo，并尝试用公司合成的磷酸化gDNA和我们自己用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231细胞中的层粘连蛋白B1和LBR基因。每个基因有5个gDNA，通过T7分析没有发现切割。同时，我们切割整合到基因组中的gfp基因，并使用韩春雨文章中使用的gDNA，通过流动检测gfp荧光没有减少。我们还将NgAgo与荧光蛋白融合，使用靶向端粒的gDNA，并使用高倍荧光显微镜，我们发现在端粒上没有NgAgo的富集。

6.中国科学院动物研究所李伟课题组

我们在哺乳动物细胞和胚胎上进行了基于NgAgo的基因组靶向突变实验，使用了293个细胞和4个相同的导向序列，并在韩国文章中进行了报道。结果是阴性的，并且没有检测到目标DNA突变。具体实验包括:1 .用体外原核表达纯化的NgAgo和韩国文献报道的4个导向序列进行37条单链DNA切割。结果:37例未检测到DNA断裂。2.哺乳动物细胞实验。按照本文附录中的方法，分别用G5、G10、G27、G28和我们设计的Mecp2基因导向序列转染293个细胞。T7EI酶切检测未检测到靶位点突变。进行引导-DNA连续转染实验，并且通过在转染后8小时和12小时补充转染引导，仍然没有检测到靶位点的突变。3.小鼠胚胎实验:选择胚胎着床点2和胚胎着床点3，分别设计几个引导序列。细胞质注射与NgAgo基因一起进行。收集胚泡检测结果。T7EI和测序分析未检测到靶位点的突变。

7.中国科学院上海科学院神经科学研究所研究员杨辉课题组

我们为小鼠胚胎的绿色荧光蛋白基因和酪氨酸基因设计了四个gDNA(由三家公司合成)。NgAgo使用了三种不同的版本(密码子优化或NLS在N端和C端)，操作了数百个胚胎，生产了300多只小鼠，没有发现敲除。之后，我们在细胞水平上对猴子的Tyr基因、293的GFP基因和N2A的Tyr基因进行了操作，没有检测到任何基因编辑。最后，我们完全遵循了韩文文章中图4的DYRKIA基因，它一点效果也没有。

8.上海交通大学吴强研究组

在高温条件下，gDNA可以引导tGago在体外切割单链DNA，pGago可以在高盐条件下切割单链DNA，NgAgo可能是一种单链核酸内切酶，在嗜盐古细菌中含有类似的核糖核酸序列结构域，但也可能切割单链DNA。我们使用密码子优化后合成的NgAgo进行以下体内编辑实验，但我们没有进行体外实验:

1个单位点:在小鼠胚胎、小鼠N2A细胞和人HEC-1B细胞中没有检测到活性，无论是人工合成的5’磷酸化的gDNA还是用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5’羟基获得的gDNA。

两个地点:三个学生花费了最多的精力。制作了至少三个不同的DNA片段，测试了不同的温度、盐离子浓度、多重转染、体外NgAgo蛋白合成然后转染、不同的Tag或核定位序列以及不同的细胞系。我们用聚合酶链反应来检测大的脱氧核糖核酸片段的缺失。这种方法非常灵敏(使用CRISPR/Cas9很容易)，因为只有当片段被删除时，聚合酶链反应产物才能被扩增，即使效率非常低。对聚合酶链反应产物进行了克隆和测序，但从未检测到片段敲除的正确结果。

9.温州医科大学谷峰研究组

我们使用携带绿色荧光蛋白的人细胞，同时引入磷酸化的gRNA和NgAgo表达质粒(几种不同的浓度梯度和重复)，希望特异性地看到绿色荧光蛋白敲除，并使用CRISPR/Cas9作为阳性对照，但NgAgo组我们不能检测到绿色荧光蛋白失活。我们后来重复了实验，但仍然没有看到切口。因此，在这个时候，我们高度怀疑NgAgo的活动，项目首先停止。