施一公研究组又在《科学》发文了！

2018年5月25日，清华大学生命科学研究所施一公教授研究团队在《科学》杂志上发表了另一篇关于拼接体的装配机理和结构的长篇文章，发表了另一项重大研究成果。这篇题为“活化前完全组装的酿酒酵母接合体的完全组装结构”的论文报道了活化前酿酒酵母接合体的两个完全组装的关键构象——预催化。预催化接合体(定义为“预硼复合物”)和预催化接合体(定义为“硼复合物”)。这两种高分辨率三维结构的总分辨率分别为3.4.6埃和3.9埃，首次显示了剪接体组装过程中前体基因5’剪接位点和分支点的识别状态和动态变化。它们回答了剪接体活化前前体mRNA的5’剪接位点和分支点的识别机制，以及5’剪接位点和分支点在活化过程中如何逐渐进入活性位点，剪接体如何逐渐组装并最终通过结构重组完成活化等重要问题。

RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一。20世纪70年代，科学家首次发现了真核基因的不连续性，从而表明遗传信息从脱氧核糖核酸转移到核糖核酸后，需要经历有效遗传信息的“剪切”和“剪接”。有效遗传信息的剪接和“无效”遗传信息的去除被称为核糖核酸剪接。核糖核酸剪接在真核生物中很常见。随着物种的进化，含有内含子的基因数量增加，RNA剪接的频率相应增加，使得一个基因编码多种蛋白质成为可能。核糖核酸剪接的本质是两步酯交换反应。这种看似简单的化学反应很难在细胞中单独发生，它是一种大而高度动态的分子机器——细胞核中的接合体，负责进行这种化学反应。在剪接反应过程中，各种蛋白质-核酸复合物和剪接因子以高度精确的顺序结合和解聚，以形成预先组装的复合物U4/U6。U5三snRNP(U4/U6。U5三核核糖核蛋白复合物)和剪接体前体-B，B，Bact，B*，C，C*，P和ILS复合物。

由于拼接体的高动态性和复杂性，获得不同状态下拼接体的高分辨率三维结构被认为是一个世界性的问题。在这个巨大的挑战下，施一公教授带领研究团队迎接了挑战。经过7年的努力，2015年首次报道了3.6埃高分辨率的酿酒酵母剪接体结构，并首次展示了剪接体催化中心的近原子分辨率结构。这一重要的研究成果对RNA剪接机制的研究具有革命性的影响。自2015年第一个剪接体结构发表以来，石研究小组已成功分析了6种不同状态的酿酒酵母剪接体复合体的高分辨率结构。预组装复合体U4/U6的结构。3.8埃的U5三snRNP、3.5埃的活化配合物Bact配合物、第一步催化反应后的3.4埃的配合物C配合物、第二步催化活化后的4.0埃的C*配合物、两步酯交换反应完成后的3.6埃的配合物和3.5埃的离子液体配合物。这些分解的剪接体基本覆盖了整个核糖核酸剪接周期，从分子水平揭示了剪接体催化两步核糖核酸剪接反应的工作机制，为理解剪接体活化和解聚过程提供了基础。然而，仍然很难清楚地解释接合体是如何一步一步组装起来的以及激活机制是如何完成的，并且新发表的文章中分析的两个关键状态接合体弥补了该领域这部分研究的缺陷。

本文报道的两个完全组装的接合体结构在从复合体的纯化、样品的制备到结构的分析的每一个步骤中都非常具有挑战性。前硼复合体由U1 snRNP、U2 snRNP和U4/U6组成。U5 tri-snRNP。目前，它被认为是蛋白质组成和分子量最大的剪接体。这种状态的结构是复杂的，但是组分之间的相互作用并不紧密，使得该复合物在纯化过程中容易解聚。在最近发表的《科学》杂志文章中，石研究组对纯化方案进行了多次探索，最终优化出一套性能稳定良好的前-B复合样品。随后，利用单粒子冷冻电子显微镜技术重建了U1 snRNP、U2 snRNP和U4/U6的结构。部分分辨率高达3.3埃、3.6-4.6埃和3.4埃的U5三snRNP，并建立了原子模型(图1)。

图1酿酒酵母预催化剪接前体和预催化剪接前体的三维结构

本文所分析的前-B复合结构是目前世界上唯一被分析的结构，同时包含五个核糖核蛋白(snRNP)剪接体结构。它由68种蛋白质和6种核糖核酸组成。在该结构中，在剪接装配的早期阶段，首次观察到U1 snRNP对5’剪接位点的识别和五种核糖核蛋白之间的相互作用界面。同时，本文还报道了另一种完全组装的接合器在预催化接合器B复合物之后的高分辨率三维结构。根据B复合物的结构信息，通过结构比较可以清楚地看到，在组装过程中，前体基因的5’剪接位点在开始时被U1单核苷酸识别，然后由于构象变化而被转移并与U6单核苷酸配对，这为剪接体激活提供了结构基础。此外，分支点的动态变化，结构重组和构象变化所经历的每个组成部分的剪接体也清楚地介绍。在文章的最后，作者还根据前B的结构特征，大胆地推测了最早的不完全组装前拼接体(定义为“复合体”)的三维结构模型(图2)。对这两种关键状态的剪接体结构的分析，为揭示如何识别5’剪接位点和分支点、如何进行结构重组以及如何在剪接装配的初始阶段完成剪接体的激活提供了最直接有效的结构证据，也为高等真核生物选择性剪接的研究提供了结构基础和理论基础。

图2预剪接酵母的三维结构预测及剪接装配和激活模型

到目前为止，石研究小组已经分析了酵母中9个不同状态的剪接体的高分辨率三维结构(如图3所示)。从组装到活化，从两步酯交换反应到剪接体的解聚，这九种状态的剪接体完全覆盖了剪接途径。剪接介导的核糖核酸剪接过程首次串联起来，为理解核糖核酸剪接的分子机制提供了最清晰和最全面的结构信息。

图3石课题组分析的酵母碎片结构概述

(照片来源:石实验室)

清华大学生命学院的施一公教授是本文的通讯员。清华大学生命科学研究所三年级博士生、医学院博士后万、生命科学研究所博士后阎创业是本文的合著者。清华大学冷冻电子显微镜平台的雷建林博士为冷冻电子显微镜的数据采集提供了帮助。电子显微镜数据收集自清华大学冷冻电子显微镜平台，计算得到清华大学高性能计算平台和国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的支持。这项工作得到了北京结构生物学高级创新中心和国家自然科学基金的支持。

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