新研究：新冠患者病毒存在快速进化风险，需更多序列追踪进化

新冠状病毒的进化速度以及病毒与受感染肺部其他微生物的相互作用方式仍不清楚。最近，国际学术期刊《临床传染病》发表了一篇来自中国研究团队的学术论文:《2019年冠状病毒病患者中SARS-cov-2的遗传多样性》，重点关注上述问题。

研究小组对8名新发肺炎患者、25名社区获得性肺炎患者(CAP，指在医院外发生的肺实质炎症)和20名健康对照者的支气管肺泡灌洗液进行了转录组测序。研究表明，在一些新感染的个体中，病毒的多样性水平有所增加，这表明病毒处于快速进化的危险之中。尽管没有证据表明宿主内变异的传播，但这种风险不应被忽视。

研究小组还表示，病毒在感染后会在患者体内进化，这可能会影响病毒的毒性、传染性和传播性。尽管尚不清楚宿主体内的变异是如何在群体中传播的，但有必要加强对群体中病毒进化和相关临床变化的监测。

值得注意的是，患者新冠状病毒的基因组可能高度多样化，这也可以在其他病毒中观察到。高多样性可能会增加病毒群体的适应性并使其难以消除。还需要进一步的研究来探索这可能如何影响对病毒的免疫反应，以及是否存在影响人体内或传播过程中不同菌株的选择。

该研究得出结论，总的来说，该研究揭示了病人体内新冠状病毒的进化，这是大多数核糖核酸病毒的共同特征。这些变异如何影响病毒的适应性和种群的遗传多样性需要进一步研究。目前，公共数据库仅共享有限的序列，因此迫切需要积累更多的序列来跟踪病毒基因组的进化，并将这些变化与临床症状和结果联系起来。

论文团队成员来自以下单位:中国科学院北京基因组研究所；中国科学院大学；中国医学科学院病原生物学研究所国家卫生委员会重点实验室；北京大学生物医学前沿创新中心；北京大学人民医院呼吸内科；广东省新发传染病诊疗重点实验室和新发传染病国家重点实验室；福建省人民医院；Xi交通大学第一附属医院；中国科学院动物进化与遗传学前沿交叉优秀创新中心等。本文作者是中国科学院北京基因组研究所研究员、博士生导师李明坤。

新感染冠状病毒患者体内高水平变异

根据目前的数据，估计早期新冠状病毒的基本传播数(R0)在2.2至3.5之间，对公众健康构成严重威胁。最近的研究已经确定蝙蝠可能是新冠状病毒的来源，这种病毒可能使用与非典病毒相同的细胞表面受体，即乙酰乙酸。这些研究提高了我们对新冠状病毒的理解。然而，我们对新病毒的了解仍然有限。

在人体内，新的冠状病毒必须承受强大的免疫压力，这可能导致病毒不断积累突变，从而突破免疫系统的控制。这些突变可能导致新冠状病毒毒力、传染性和传播性的改变。因此，研究人员认为有必要研究突变的模式和频率。

研究小组对感染了新冠状病毒的8个支气管肺泡灌洗液(BALF)样本的转录组进行了测序。在2019年12月24日至2020年2月9日期间收集的110个序列发现，宿主内的变异数在0和51之间，中位数为4，表明病毒的进化率非常高。

研究小组共鉴定出84种宿主内变异，其中最小等位基因频率(MAF，通常指给定群体中不常见等位基因的出现频率)大于5%，MAF的25种变异大于20%。

值得注意的是，突变的数量与测序深度无关。

总的Ka/Ks比率(同义替换(Ka)和同义替换(Ks)之间的比率可用于判断是否有选择压力作用于该蛋白质编码基因)明显小于1，这类似于宿主中的变异和在群体数据中观察到的多态性，表明纯化选择作用于两种类型的突变。

在基因中观察到的变异数与基因的长度成正比(对于宿主内变异，cor=0.950，P = 8E-06；对于多态性，cor=0.957，P = 4E-06)。尽管在多名患者中仅观察到少量突变(图2C，84名患者中的2名)，但突变更可能发生在某些位置，例如位置10779，在所有7名患者中观察到突变等位基因a，频率范围为15%至100%。

各个体宿主内变异数差异显著(MAF ≥ 5%变异数为0 ~ 51，中位数为4；MAF≥20%%的变异为0-19，中值为1)，不能用于批次效应、覆盖率差异或污染(一批新冠状病毒感染1-4的nCoV1-4，另一批新冠状病毒感染5-8的NCoV 5-8；大多数突变在群体数据中没有观察到)。研究小组还指出，变异量与症状出现后的天数或患者的年龄无关。

总的来说，在新感染的第六型冠状病毒中，还没有发现异常高水平变异的原因(51种变异)。

研究小组表示，需要更大的群体规模来研究这种异常值的频率，以及它们是否与宿主免疫反应水平或病毒复制率有关。研究人员还注意到其他病毒的异常价值。值得注意的是，突变的来源可能是感染后在体内发生的突变，也可能是一种具有多重传播的新冠状病毒株。

研究小组在讨论中提到，核糖核酸病毒有很高的突变率。因此，核糖核酸病毒容易产生抗药性，逃避免疫监视。新冠状病毒的突变率仍不清楚。然而，这项研究得出结论，新冠状病毒的突变率应该与非典冠状病毒的突变率处于同一数量级。高突变率也导致了高水平的核糖核酸病毒宿主内变异。对于频率≥ 5%的变异体，新冠状病毒肺炎患者肝内变异体的中值为4。发病率与埃博拉病毒疾病研究报告的发病率无显著差异(134份样本中有655种变异，频率≥5 %, p > 0.05)，表明新冠状病毒的突变率也相当于埃博拉病毒。

此外，先前的研究表明，核糖核酸核酸外切酶(外显子)可以在传染性非典型肺炎冠状病毒中提供纠正活性，并指出该基因的所有三个关键基序在传染性非典型肺炎冠状病毒和新的冠状病毒之间是相同的。此外，在这些基序中没有检测到多态性或内部变异，表明该基因高度保守，因此它可能是抗病毒治疗的潜在靶标。

研究小组指出，尽管在宿主的多态性或变异中没有发现突变热点基因(突变概率较高的碱基序列)，但在不同个体之间观察到宿主的共同变异，这意味着病毒在患者体内有适应性进化的可能性，这可能影响其抗原性、毒力和传染性。

值得注意的是，患者新冠状病毒的基因组可能高度多样化，这也可以在其他病毒中观察到。高多样性可能会增加病毒群体的适应性并使其难以消除。还需要进一步的研究来探索这可能如何影响对病毒的免疫反应，以及是否存在影响人体内或传播过程中不同菌株的选择。

没有证据表明样本之间宿主内的变异扩散。

在八名新感染冠状病毒的患者中，第4位感染者(第4位)和第7位感染者(第7位)来自同一个家庭，症状出现的日期相差五天。高度怀疑该病毒是从受感染者4传染给受感染者7的，特别是考虑到只有受感染者4进入了武汉的中国南方的海产品市场，该市场是暴发的起点，并且被怀疑是新冠状病毒的来源。

首先，对于这两个样本，病毒的共同序列是相同的，并且在受感染者中没有检测到通过四个受感染者选择标准的所有四种宿主内变异。研究人员进一步将研究范围扩大到MAF ≥ 2%的所有变体，并获得了至少3个阅读片段的支持。通过这样做，研究人员在两个样本之间总共检测到7个变异(总共25个)。

然而，第4和第7感染源中的MAF与其他样本中的MAF相似，这表明这些位置容易出错或发生突变。因此，他们不能支持这些突变的传播。

同时，在所有84个宿主内部变异中，只有3个在群体数据中是多态性的(位置7866克/吨；；27493摄氏度/吨；28253摄氏度/吨).这种少量的重叠也表明宿主内的变异很少传递到其他样本。然而，不能排除目前的数据库低估了群体中序列多样性的可能性。

研究小组在讨论中还提到，在本研究的单一传播事件中，研究小组没有发现多重菌株传播的证据。然而，尚不清楚这些内部变异是在传播之前还是之后发生的，这也将导致不同的结论。此外，沟通可能会遇到瓶颈，这也可能导致多样性的丧失。

在新加冕的患者中没有发现特定的微生物群模式。

除了病原体，肺部的其他微生物也与疾病的易感性和严重性有关。肺部微生物群的变化可能改变对病毒和继发细菌感染的免疫反应。因此，了解包括可能导致继发性感染或影响粘膜免疫系统的细菌在内的微生物群可能有助于预测和减少并发症。

黏膜免疫系统是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜下层和某些外分泌腺的淋巴组织。它是执行局部特异性免疫功能的主要场所。

总的来说，在新感染冠状病毒的患者、社区获得性肺炎患者和健康人群中，微生物群的组成存在显著差异(R2=0.07，p=0.001)。

然而，对来自一些新的冠状病毒感染个体的样本的聚类分析显示，一些样本的微生物种群相对较差。去除有问题的样本后，研究仍发现感染新冠状病毒的患者和社区获得性肺炎患者不同于健康对照组(感染新冠状病毒的患者和健康组:R2=0.45，p = 0.001；社区获得性肺炎患者和健康组:R2=0.10，p=0.002)，表明其肺部菌群存在微生态失衡。微生物可以分为三种不同的类型。特别是，群一中的微生物主要是由可能的病原体引起的，而其他群中的微生物更加多样。

通过对每一类群的物种进行进一步调查，研究小组发现，第三类细菌主要是口腔和呼吸道中常见的共生细菌，而第二类细菌主要是环境微生物，因此非常怀疑这实际上是被污染的。因此，微生物种群或者富含病原体(第一类)，或者富含共生细菌(第三类)，或者由于微生物负荷低而无法确定(第二类)。

在八名受试者中，六名新感染冠状病毒者样本中的微生物群富含病原体，而另外两个样本则富含共生细菌。此外，两种宿主中新冠状病毒突变量过多的新冠状病毒感染者(感染者2和6)的样品都富含病原体。

该论文提到，病毒的压倒性优势可能与更高的复制率有关，也可能潜在地刺激针对病毒的强免疫反应，在这种情况下，预计宿主中会发生太多的突变。然而，由于该分析仅包括8名新的冠状病毒感染者，且绝对微生物载量尚不清楚，因此需要更多数据进行进一步研究。

研究人员讨论并指出，除了肺炎组的微生物多样性明显低于健康对照组的特点外，他们在新发肺炎患者中没有发现任何特定的微生物种群模式，在CAP患者中也没有发现任何特定的微生物种群模式。一个可能的原因可能是肺炎患者使用了抗生素。然而，这并不适用于所有肺炎样本，因为在一些样本中发现了相当大比例的细菌，包括2名新患肺炎的患者。

目前，众所周知，病毒感染，尤其是呼吸道病毒的常见并发症，继发性细菌感染往往导致发病率的显著增加。因此，BALF某些新发肺炎患者细菌水平的增加可能会增加继发感染的风险。在临床数据中，新冠状肺炎患者的继发感染率在1%至10%之间。然而，细菌相对丰度/滴度和感染之间的定量关系仍然不清楚。

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