打破疫苗研制的“天花板”

资料来源:生物科学学士

每当我们达到一个新的“上限”，我们将在几年内打破它。

疫苗是科学对抗感染的胜利。他们战胜了天花，世界卫生组织在1980年宣布天花已被彻底根除，并大大减少了许多其他传染病的死亡人数。

但这还不是全部。美国国家卫生研究院疫苗研究中心的免疫学家马里奥·罗德尔(Mario Roeder)表示，研究人员对人类免疫系统了解不足，阻碍了对艾滋病和疟疾等疾病疫苗的研究。

罗德尔说，研究人员普遍知道，一种成功的疫苗将有助于启动抗体生产和其他防线。然而，他们不知道在免疫系统中的数千或更多类型的细胞中，哪一种起作用，引导对单一病原体的反应。罗德尔说，如果研究人员能识别这些细胞类型，他们就能设计出最大限度生产这些细胞的疫苗。

识别这些细胞的最佳方法之一是流式细胞术。它可以根据细胞的独特特征(通常是外表面的蛋白质)对细胞进行分析和分类，并显示大量关于细胞在免疫系统中的功能和位置的信息。然而，目前这一代的流式细胞仪不够详细，只能对细胞进行广泛分类，类似于简单地识别鱼而不是大白鲨。

识别特定细胞的能力也可以帮助研究人员了解诸如多发性硬化症和转移性癌症等疾病。在多发性硬化症中，免疫系统攻击接受者自身的组织，而在转移性癌症中，危险细胞从原肿瘤转移到其他组织。

这种可能性激发了研究人员开发两种新方法，预计到2016年，每种方法都将是传统技术的三倍甚至三倍。一种方法是对标准流式细胞仪的改进，它使用一种新的荧光染料，可以识别27种蛋白质。斯坦福大学的免疫学家加里·诺兰(Garry Nolan)说，另一种叫做大量细胞计数的方法可以记录50个参数，如细胞表面蛋白质或蛋白质成分。

开发新染料

像免疫系统一样，流式细胞术使用抗体来寻找蛋白质。首先，研究人员为他们想研究的每一种蛋白质制造抗体，然后用吸收光并发出特定颜色荧光的染料分子标记抗体。

随后，将待研究的样品“浸入”标记的抗体中，该抗体可以粘附到携带相应蛋白质的细胞上。用抗体修饰的细胞一个接一个地通过狭窄的通道。当它们通过时，光脉冲触发染料发光，显示细胞表面存在的蛋白质。每种染料发出的光以不同的波长散开，形成一个看起来像山峰的阅读器。

目前，流式细胞仪一次只能处理18种以上的荧光染料，因为当超过这一数量的染料同时发出荧光时，一些光谱的肩状突起会与其他峰重叠，使峰无法识别。

一个共同的因素是不同细胞中每种蛋白质的丰度差异很大。表面有成千上万种特定蛋白质的细胞吸引许多带有相同标记的抗体，它们结合在一起产生非常明亮的荧光。数量较少的蛋白质产生相对微弱的信号，这些信号可能被更丰富的蛋白质的信号淹没。

罗德尔说，研究人员可以通过用更亮的染料标记针对不太常见的蛋白质的抗体来进行补偿，但是通常不能提前知道蛋白质的相对丰度。因此，他们可能不得不花费数周时间依靠反复试验来确定使用哪种抗体和哪种染料。

然而，这将很快完全改变，因为研究人员已经开发了一种新的染料。它们由导电塑料聚合物制成，可以吸收多个点的光脉冲能量，像微型天线一样发出荧光，从而产生更强的信号。罗德尔说，当用于流式细胞术时，强信号会淹没其他染料的任何重叠，即使是低丰度的蛋白质。这意味着可以同时使用更多的染料。罗德尔的团队已经使用染料研究了免疫细胞表面常见的30种蛋白质，尽管结果尚未公布。

其他研究小组正在使用两家加州公司的染料。这两家公司是圣何塞的生物科学和圣地亚哥的生物工程。然而，罗德尔没有听说过其他人能同时成功测量超过18个参数。

目前，罗德尔计划使用这些染料来研究针对各种疾病的候选疫苗，包括埃博拉、疟疾、结核病和艾滋病。在人类志愿者身上测试埃博拉疫苗已经成为当务之急。罗德尔加入了由南希·苏利文领导的团队，他也是疫苗研究中心的免疫学家。他们缩小了保护猴子免受埃博拉感染的细胞范围。罗德尔希望通过使用更多的染料来识别赋予猴子免疫力的细胞群体。此后，沙利文和罗德尔希望调整疫苗剂量和注射时间表，以便人类免疫系统能够产生和支持这些细胞。

用稀土金属替代非荧光染料

当罗德尔在新染料方面取得进展时，位于加州桑尼维尔的DVS科学公司正从另一个方向使用流式细胞仪。该公司现已更名为Fluidigm，于2009年首次引入商业质谱流式细胞术技术，并于2013年首次推出新一代细胞因子CyTOF 2)。

像流式细胞术一样，质谱流式细胞术包括将细胞浸入标记的抗体中，然后将它们插入狭窄的流动通道中，并逐一进行筛选。然而，这是两种技术的相似之处。质谱流式细胞术使用生命系统中“不存在”的稀土金属来取代荧光染料标记的蛋白质。与此同时，它并没有通过细胞发出的荧光来显示蛋白质的存在，而是利用血浆将细胞分解成构成细胞的原子。这些含有稀土标记的原子随后被送到质谱仪，以测量每种金属的质量和丰度。因此，每个相应蛋白质的同一性和丰度被测量，并且荧光染料的信号重叠问题不再存在。

诺兰领导的团队利用这项技术在髋关节置换手术后康复的患者中寻找特定的免疫细胞群。该团队在手术前后的不同阶段从每个病人身上采集血液，并使用质谱流式细胞仪追踪31种蛋白质。在那些恢复迅速的患者中，研究人员发现了一种叫做单核细胞的独特免疫细胞。斯坦福大学的病理学家肖恩·本道尔(Sean Bendall)是这项研究的参与者之一，他说，他们目前正在研究这些细胞是否可以用来预测哪些患者可能会延迟康复，从而提供可以缩短康复时间的干预措施。

质谱流式细胞术和荧光流式细胞术在一些相同的研究应用中相互竞争，研究人员通常有一种首选技术。Roederer认为，质谱流式细胞术可以破坏细胞，而荧光流式细胞术可以保护细胞，甚至可以同时对它们进行分离和分类。

然而，本德尔没有同样的担心。他热情地支持质谱流式细胞术技术，但是他说他经常听到关于细胞破坏的反对意见。本道尔解释说，许多人不会仅仅因为这个就考虑这项技术，但是细胞破坏“从来不是我们想做的任何事情的障碍”如果使用质谱流式细胞仪的测试确定了一种关注的细胞类型，研究人员总是可以利用这种信息在传统流式细胞仪的帮助下分离活细胞。

画一幅完美的画

诺兰、本道尔和罗德尔都同意一件事:金属标记最有希望的应用是它们改善未受损组织切片图像的潜力。然而，这不能通过荧光流式细胞术或质谱流式细胞术来实现，因为这两种技术都需要将细胞分散到液体流中。

一种类似的应用，称为复合离子束成像，将金属标记物应用于组织切片，然后将大量氧离子注入其中。氧离子与金属标记物反应，并从伴随的抗体中去除。质谱仪然后测量金属原子从组织中反弹出来的情况。

斯坦福大学病理学家米开朗基罗说，他用这项技术测量了每个细胞的45个参数。同时，例如，该方法还记录肿瘤中细胞的位置。"这些是传统成像或基于流式细胞术的技术永远做不到的事情."罗德尔说。

去年，诺兰团队将这项技术应用于乳腺癌患者的组织样本，并使用了10种标记有金属标记的抗体。这项技术产生组织样本的高清晰度图像，随后以不同的颜色呈现，以显示单个蛋白质的位置。

在一项相关的研究中，瑞士苏黎世大学的免疫学家贝恩德·博登米勒和瑞士联邦理工学院的化学家德特勒夫·贡特及其同事开发了一种匹配仪器。它可以记录细胞的位置，并指示组织中的紫外激光以有序的方式去除标记细胞，然后将它们送至大规模细胞分析仪进行分析。博登米勒说，该仪器可以分析多达40种标记。然而，Fluidigm的首席技术官斯科特·坦纳(Scott Tanner)表示，有更多的金属标记可供使用，因此研究人员可能很快就能进行测试，获得更多的参数。

该技术产生的图像可以说明细胞如何对局部条件如肿瘤中的缺氧环境做出反应。"它会给你更多关于样品性质的信息."坦纳说。

他还说，质谱流式细胞术成像的应用不仅限于癌症。神经生物学家告诉他，他们希望用它来研究神经元在大脑或脊髓中的分布。分析多种蛋白质的能力有助于研究人员解读神经细胞的功能，以及它们与相关神经元网络中细胞位置的关系。

罗德尔和诺兰不断打破界限，但罗德尔说他经常对这些改进的有用性产生怀疑。当他得到8个参数时，研究人员会质疑这么多参数是否真的有必要。“当我12岁时，人们会问，‘这够了吗？’你已经完成了吗？”罗德尔回忆道。

他没有停下来。罗德尔希望明年能达到40个参数，之后还会有更多。"每当我们达到一个新的上限，我们将在几年内打破它."(宗华)

中国科学新闻(2015-03-04第三版国际版)

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