科学家建人造精子介导高效产生点突变小鼠新方法

(记者黄鑫)中国科学院生物化学与细胞研究所李劲松课题组和第二军医大学长征医院文渊课题组在最新研究中将CRISPR-Cas9基因编辑技术和半克隆技术相结合，实现了点突变小鼠的高效制备。相关的研究结果最近发表在国际学术期刊《遗传学杂志》的网上。

点突变小鼠模型的建立，尤其是致病基因点突变小鼠模型的建立，对于研究基因的功能和疾病的发病机制非常重要，但传统的通过同源重组编辑胚胎干细胞的方法费时费力。近年来，携带点突变的小鼠可通过CRISPR-Cas9直接注射受精卵获得，但生产携带点突变小鼠的效率不高，存在个体基因型嵌合现象。李劲松课题组前期研究建立了小鼠孤雌雄性单倍体胚胎干细胞(AG-haESCs)和注射入卵获得健康小鼠的半克隆技术，进一步优化了获得单倍体干细胞(又称“人工精子”)的技术，能够稳定高效地产生半克隆小鼠，为快速制备携带感兴趣点突变的小鼠模型提供了一种新方法。研究人员首先使用携带点突变的单链寡脱氧核苷酸(ssODN，长度99个碱基)作为修复模板，并将CRISPR-Cas9转移到单倍体细胞中。发现随着靶突变位点和Cas9酶切割位点(即DNA双链切割位点)之间距离的增加，同源重组获得携带突变位点的细胞的效率急剧下降。当距离大于或等于≥10bp时，使用ssODN作为模板的效率太低而不能检测，并且不能获得携带这些位点的突变细胞。因此，该项目团队构建了一个携带点突变的双链载体作为模板(长度为258bp-2.1kb)，并发现同源重组的效率可以显著提高。同时，发现当载体长度为1-1.5kb时，同源重组效率最高。研究人员进一步建立了携带点突变的单倍体细胞系，并通过卵注射有效地获得了携带感兴趣点突变的小鼠模型。研究人员提出，在致病点突变的模拟过程中，当突变位点与DNA双链断裂位点之间的距离小于10bp时，可以用ssODN作为模板。当突变位点与DNA双链断裂位点之间的距离大于或等于10bp时，以载体为模板效率更高。

据报道，魏磊新和王修坤是本文的第一作者。