科学家用混合方法了解细胞动态与功能

来源:斯坦福大学

伊娃·诺加莱斯和其他结构生物学家一样，玩得很开心。加州大学伯克利分校的教职员工现在可以使用新工具来解决几年前无法解决的细胞和分子机制。

最近，Nogales和Jennifer Doudna之间的合作项目是一个很好的例子，Jennifer Doudna是CRISPR-Cas9的同事、分子生物学家和共同发明人。他们都对R环非常感兴趣。在许多情况下，在DNA被CRISPR-Cas9切割之前，细胞中会形成一个由核苷酸组成的R环。Nogales等人对化脓性链球菌中的R环进行了成像，并获得了近原子分辨率的结构图像，这表明Cas9酶如何在特定位点打开DNA，并使其成为CRISPR分子剪刀的有用工具。

这项工作的突出之处在于，科学家可以快速将功能与结构联系起来，并且可以将成像方法结合起来。一个多世纪以来，结构生物学的首选方法是X射线晶体衍射。然而，一些生物分子太大或太小而不能结晶，因此不能使用x光。此外，一些分子在发挥功能时会改变形态或方向，结晶无法捕捉这些变化。

现在，科学家有一个庞大的成像工具库。低温电子显微镜或化学家核磁共振成像等方法可以获得接近原子分辨率的结构图像，而无需结晶，从而揭示分子的形状、大小和方向。然而，并不是所有的方法都适用于活细胞中的所有蛋白质和核酸。

经验证明，没有单一的方法足以研究细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。最佳解决方案是集成来自多个工具的图像。

这种方法赢得了许多追随者。斯坦福大学的结构生物学家罗杰·科恩伯格指出，每一种方法都可以提供一些重要的信息，结合起来，就可以达到1+1>2的效果。科恩伯格因在揭示基因转录机制方面的贡献而获得2006年诺贝尔化学奖。为了这一突破性的研究，他使用了x光晶体衍射法。现在，像其他晶体学家一样，他开始结合使用各种方法。

科恩伯格继续分析核糖核酸聚合酶2，但现在他将冷冻电子显微镜和结晶学结合起来。与晶体技术相比，冷冻电子显微镜可用于不易结晶的生物分子，并可分析较大的分子，但目前的分辨率略低。科恩伯格实验室还使用化学交联和质谱来揭示相邻蛋白质之间的关系，并使用已知的蛋白质信息进行同源性建模。

同时，Nogales和Doudna团队也使用混合方法来研究r环。诺加莱斯说，“高分辨率x射线晶体方法不能分析完整的r环结构。”因此，他们用冷冻电子显微镜在低分辨率下分析了完整的环状结构。只有将两者结合起来，研究人员才能真正揭示R环在CRISPR-Cas9中的作用。

这种混合或综合的方法有助于研究人员深入研究基本的科学问题，对药物开发人员也非常有用。细胞膜上的大蛋白质通常是治疗目标，高分辨率杂交方法可以揭示药物-受体相互作用的原子细节。同样，通过展示艾滋病毒、埃博拉病毒和其他病原体的包膜蛋白与免疫细胞之间的相互作用机制，可以促进疫苗开发。纳什维尔范德比尔特大学的结构生物学家詹斯·梅勒说，这些结构对于人们理解免疫系统的工作机制非常重要。

诺格拉斯总结道:“这是混合方法的黄金时代。”

梦想成真

德国欧洲分子生物学实验室(EMBL)细胞生物学和生物物理学部主任简·埃伦伯格说，这个时代是许多生命科学家梦想成真的时代。这个梦想从原子层面无缝连接到细胞层面。对细胞大分子的深入理解可以自然地回答结构生物学的首要问题:分子的结构是如何与其功能联系在一起的？

结构生物学家工具箱中的每项技术都提供了不同的视角。生物学家认为混合模型能够准确地反映细胞中分子或复合物的行为。梅勒说:“你需要结合这些技术来得到一个全面的答案。”

x射线晶体衍射一直是测定蛋白质原子结构的标准方法。在1971年建立的蛋白质数据库拥有的120，000个模型中，大约90%来自结晶学。

然而，对于结构生物学家来说，尽管该技术具有高分辨率，但也有局限性。首先，样品应经过高度纯化，以产生有序晶体。科学家通过分析原子如何散射光来确定分子结构。这项技术需要足够的原子来产生可测量的衍射图样，而且每一个晶体都必须是静态的。因此，这种方法不能揭示一个分子如何运动和起作用，也不能揭示它如何与其他系统相互作用。

德国复杂系统研究所计算结构生物学小组的负责人贡纳·施罗德指出，蛋白质不仅仅是一个静态结构，“通常，你想看到的是整个蛋白质是如何工作的”。施罗德使用混合方法来理解蛋白质的行为及其相互关系。当蛋白质离开正常环境时，结晶学可以提供它的快照。然而，结构生物学家需要其他方法来补充晶体结构信息，提高他们对蛋白质形态和功能的理解。

此外，许多蛋白质，如细胞膜上的药物靶标，是灵活和不稳定的。为了让这些蛋白质形成晶体，研究人员通常必须在一定程度上改变它们。梅勒指出，改变样本可能无法准确反映分子的原始生态和它们在细胞中的排列。他将实验和计算方法结合起来，以便更好地理解分子结构。"晶体法是一种很好的初始方法，但这种方法不足以提供功能信息."他说。

帮我一个小忙

Nogales等人使用的混合策略已经获得了10埃的整体分辨率，这比之前分析的30埃分辨率有了很大的改进。分辨率的提高带来了新的视角。正如诺加莱斯所说，“我们可以看到氨基酸和DNA之间的相互作用”。

然而，冷冻电子显微镜需要冷冻标本。这并不理想，因为冷冻样品远离它们的动态和自然状态。核磁共振光谱学可以解决这个问题。施罗德说，“核磁共振有很大的优势。你可以在室温下观察样品和蛋白质的动态信息。”他的实验室通过整合核磁共振、冷冻电子显微镜和晶体学数据建立了一个实验模型。

核磁共振首次应用于实验是在20世纪40年代。研究人员在外部磁场中激发原子以获得大分子结构。当原子被回收时，可以检测到它们内部磁场的变化，从而反映出分子的原子结构。然而，核磁共振波谱仅适用于相对较小的大分子或复合物。

结构生物学家也使用混合方法来分析超大复合体——这是过去无法完成的任务。科恩伯格的最新成果进一步扩展了他对核糖核酸聚合酶ⅱ的研究，并描述了一个由50多种蛋白质和转录因子组成的巨大复合体。“通过几种方法的结合，他们第一次看到了整个综合体。每种方法的贡献都同样巨大。”他说。

仍然有缺点。

虽然不同的方法可以带来更多的信息，但是混合也会导致错误的叠加。因此，混合方法的一个潜在问题是由多个误差源引起的误差增加。梅勒指出:“我关心的是如何在综合各种方法的同时减少误差，以保证所获得模型的准确性、精确性和可靠性。”

另一个障碍是共享和利用多个数据集。任何技术都可以获得丰富的信息，所以信息共享是一个挑战。冷冻电子显微镜制造商FEI的首席科学家杰弗里·兰格尔说，“每天可以产生数百万兆字节的数据”。他希望结构生物学领域可以借鉴高通量遗传生物学领域来处理数据过载。虽然有软件可以灵活地将高分辨率晶体结构数据与冷冻电子显微镜图像相结合，但通过其他方法获得的数据不能简单地混合。例如，电子顺磁共振光谱学测量聚合物的距离和方向，而冷冻电子显微镜产生密度图。尽管这两种数据的结合非常有用，但这两种数据语言并不相同。梅勒问，“我如何整合这些数据并分享它们？”

为了探索组织、共享和使用数据的最佳方式，数十名结构生物学家于2014年10月聚集在英国的欧洲生物信息学研究所。施罗德说，目前，PDB储存的数据是关于单一蛋白质结构的，并且应该增加关于蛋白质各个方面的数据。细节越丰富，全面分析蛋白质和大分子功能就越有帮助。

学术界已经做出了一些努力:目前，二维电子显微镜图像档案和三维电子数据库已经建立。这些档案由EMBL等机构资助，其中包含的数据可以共享、存档和分发。

另一个可能阻碍这一领域的威胁是专业知识。梅勒指出，“技术需要投资，但投资培养科学家也很重要。”他建议结构生物学领域的学生学习每种方法的优缺点，并至少掌握一种方法。“我们需要培养新一代科学家来理解如何整合这些不同的技术。”

最后，结构生物学家必须学会提问，提出新的、复杂的、以前认为不可能的生物问题。埃伦伯格还说，多亏了混合方法，“许多我甚至认为直到五年前退休才能够探索的问题都可以解决。”(张张)

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