科学家为研究单细胞代谢夯实技术

研究人员正在开发创新的方法来理解单个细胞的内部工作机制。资料来源:托尔斯滕·惠特曼/SPL

雷纳托·泽诺比坐在一楼的办公室里，这是一个通向牧场的工业实验室。分析化学家解释了细胞生物学家面临的一个基本问题。他正在遵循一条代表理论细胞群中分子平均浓度的曲线——一条简单的钟形分布曲线。他解释说，这种分布会隐藏复杂性。为了证明这一点，他画了两条曲线，这两条曲线与单个峰的每一边一致，每条曲线代表了群体中的典型表型，也与钟形曲线一致。“为了找出这种分布是多模态还是单模态的，你需要深入到单个细胞水平。”苏黎世瑞士联邦理工学院的泽诺比说。

细胞异质性是克隆群体中一些细菌产生抗生素耐药性的原因。它导致大脑中不同的细胞亚群，并解释了肿瘤的固态萌发。然而，监控这些差异的工具才刚刚开始。

“当前的技术进步，尤其是过去两年的技术进步，揭示了同一组细胞中的单个细胞可能有巨大的差异。”马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院共同基金单细胞分析工作组的项目主任阿南达·罗伊说，“这些差异对健康和疾病有重要影响。”

全世界的捐赠者都在排队支持单细胞研究。自2014年以来，国家卫生研究院已投资200万美元支持单细胞分析的特殊项目。目前，该计划下的60个团队已经获得奖项。日本大学和公司合作发起的单细胞测量员协会为单细胞分析和技术颁奖并举办研讨会。2016年10月，专家们讨论并启动了国际人类细胞绘图倡议，旨在绘制每个人类细胞及其特征。这项雄心勃勃的任务严重依赖单细胞分析。

微小但稳定的进步

对单个酵母细胞的分析使泽诺比的团队发现了潜伏在同一基因样本中的两种表型，一种是被称为1.6-二磷酸左旋葡萄糖的低水平代谢物，另一种是更高水平的代谢物。这种差异最终可能是由于不同的葡萄糖使用策略。泽诺比说，这一发现没有直接的生物医学应用，但它阐明了细胞工作的基本方式。

为了获得这些信息，泽诺比的团队使用了复杂的技术来分离细胞并提高其分析途径的灵敏度。泽诺比使用一种特殊的硅芯片，每种芯片可以将数百个细胞转移到质谱仪中。用肉眼看，这些硅片似乎覆盖着一层细网。这些网格是一种叫做聚硅氮烷的聚合物的外层，通过激光微机械加工形成数百到数千个储层，每个储层的直径为200到300微米。

泽诺比大学的研究生罗伯特·斯坦霍夫展示了这些硅片是如何装入质谱仪的。研究人员将基质辅助激光解吸/电离(MALDI)与飞行时间分析仪结合使用，这要求他们用化学基质驱动电离。通过使用最小化小分子产生的信号的干扰矩阵，该团队可以检测低埃范围(10-18摩尔)的新陈代谢。这样，每个硅片大约有1000个电池，在单个电池世界中相对较高。

伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的分析化学家乔纳森·斯韦德勒开发了一种高通量方法，利用计算机将激光导向硅晶片上的单个细胞。通过这种方式，该团队可以在每个硅片上加工大约10，000个电池。然而，为了更全面地观察代谢机制，斯威德勒一次只分离了一个细胞。他使用一种改进的膜片钳工具(通常可以记录电子信号)从人类脑细胞中提取大约3皮升的细胞质(相当于总量的10%~40%)，并将其转移到质谱仪中。

这些有限的通量将每个实验的分析限制在几十个细胞。然而，斯威德勒的团队已经用它检测了大鼠脑切片中30个神经元和星形胶质细胞的60种代谢。该小组主要研究神经化学物质，如谷氨酸盐，还检测了氨基酸和三磷酸腺苷衍生物。

不同的尺寸和不同的检测

在处理单个细胞时，大小非常重要。植物细胞的直径可以从10微米到100微米。哺乳动物细胞往往较小，约10-20微米。微生物细胞更小，可以达到亚微米级。由于细胞大小不同，代谢物的体积和确切数量会有所不同。“从分析的角度来看，很明显没有单一的方法来处理这些能力。”华盛顿特区乔治华盛顿大学的化学家阿科斯·维特说。他的实验室使用不同的方法来分析不同大小的细胞。

对于最大的细胞，该小组使用锋利的光纤将红外光直接传输到细胞中。光导纤维刺激细胞内水的氧氢结合，导致细胞爆发并排出内含物。这些溢出的物质会遇到一种雾化的离子化液体，即电喷雾，它能使分子带电，进行质谱分析。这种技术的优点是可以在单个细胞仍嵌入组织时进行分析。但它可能非常慢，因为每个细胞通常需要“一个非常有耐心的研究生”来探测纤维。最近，他用一台计算机控制样品台，使过程自动化。

最小的电池放置在由纳米柱覆盖的表面上，纳米柱也是由硅制成的，尽管制造方法不同于斯坦霍夫的设备。对整个表面的成像揭示了该装置的离子束需要瞄准单个细胞的位置。使用这种方法，该小组可以常规检测毫微微克分子的代谢水平(毫微微克，10-15摩尔)。然而，研究人员推测他们检测的下限是800摩尔(1摩尔等于10-21摩尔)或大约482，000个分子。

它甚至可以达到更小的水平。瑞典哥德堡大学的生物分析化学家安德鲁·尤因分析了神经囊泡的小分子成分。尤因使用一种叫做纳米材料的方法，用高能铯离子束轰击样品表面。这种攻击将驱逐表面带电粒子，可以通过质谱分析来确定物质的组成。尤因的团队用这种方法来评估多巴胺在神经囊泡中的分布。

在日本大阪RIKEN化学研究所的定量生物学中心，化学家高桥努·马苏吉马使用一段回放来针对单个细胞进行质谱分析。“单个细胞的行为非常有趣且出人意料，所以我希望尽可能多地看到它们。”马苏吉马说。

他的方法包括在视频观察期间将纳米流体喷射针直接插入细胞，吸出内含物，然后用同一根针将内含物注入质谱仪。添加视频组件使他的团队能够执行更精细的操作，例如捕获和分析血液中各个白细胞和肿瘤细胞的氨基酸和脂质含量。它还允许团队评估分子的丰度。

合理化数据

幸运的是，加州斯克里普斯代谢组学和质谱中心的化学家加里·西乌兹达克说，可以获得生物信息学工具来使这些发现合理化。Siuzdak的中心运行着一个基于云的代谢物分析平台XCMS online，有超过12，000名用户共享超过120，000份工作。Siuzdak承认单个细胞很少参与这些工作，但这并不意味着它们天生就与这些软件不兼容。“就生物信息学而言，我看不出进行这些实验的主要问题。”他说。

相反，单细胞代谢领域的主要挑战是仪器:有足够的设备来研究单细胞和每个细胞的代谢物，因此研究结果在数据方面是有意义的。"单个电池的主要问题是硬件仍然需要改进."西斯达克说。研究倾向于分析数十或数百种不同的分子。然而，一个酵母细胞大约有600种代谢物。因此，即使是最灵敏的分析技术也只能选择最容易检测的对象，通常是单个细胞内的分子。那些不常见的在雷达探测范围之外。

这个问题的潜在解决方案可能在于基于数量的工具和各种组织学。"为代谢物数据集开发的渠道和工具来自大量可重复使用的细胞群体."他说。所有需要做的就是稍微调整研究人员使用的数据处理和标准化方法。“单细胞转录组学已经建立，从中我们可以学习加速单细胞代谢物领域生物信息学的发展。”他补充道。

其他研究人员正在寻求质谱之外的单细胞分析策略，尤其是使用活细胞。海涅曼说，在单细胞代谢物研究方面，关键的技术挑战已经解决。“现在需要做的是单调的开发和有效的工作”。

“我们总是非常乐意检测独特的分子。我的问题是为什么？”马苏吉马问，“这个发现的背后是什么？这种分子为什么会出现？”如果没有这样的洞察力，这项技术将冒着制造噱头但不能解决重要生物问题的风险。"我不想成为做这种研究的科学家。"他说。

(冯伟伟编著)

《中国科学日报》(2017-012第三版国际版)