新工具帮科学家看到活细胞蛋白质

这些技术给了研究人员前进的翅膀。

荧光标记和光学成像相结合产生超分辨率图像。资料来源:韦斯利·雷根特

生物物理学家乔格·贝沃斯多夫说，2006年是荧光显微术的奇迹年。与此类似的另一年是1905年，当时爱因斯坦用相对论、量子理论和原子物理学彻底改变了物理学领域。这场显微镜革命由三篇论文组成。科学家第一次可以看到细胞内部，并追踪单个分子的行为。

"每个分子都是一台机器，一台纳米机器."贝沃斯多夫说。其中，蛋白质是特别复杂的分子，它们以各种方式弯曲和缠绕，以进行细胞代谢和生长所需的反应。"我们感兴趣的是这些微型机器是如何集成起来完成细胞功能的？"

长期以来，光学显微成像技术的发展一直受到一个物理极限值的限制，这就是德国物理学家和显微技术专家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)在1873年的预测:光学显微镜的成像效果被认为受到光波长的限制，不能突破0.2微米的分辨率极限，即光波长的1/2，以下称之为“阿贝分辨率”。

科学家们直到能够瞥见细胞内部，才知道这个问题的明确答案。光学显微镜不能提供任何帮助。超过一定放大倍数后，衍射使光散射，而不是集中在一个点上。任何距离小于200纳米或细胞膜宽度小于40倍的物体都会成为模糊点。用电子显微镜拍摄的照片可以分辨精细结构，但它们必须是静态的，不能用于活细胞。

2006年，三个实验室各自采取了类似的策略来克服“衍射障碍”:使用专业的荧光探针来分析样品。这些探头可以有选择地打开，直到所有探头都可以在一系列图像中被捕获。科学家可以把这些图像做成一幅画，就像印象派画家用彩色点来营造场景一样。这三种技术——光敏定位显微镜(PALM)、荧光PALM(FPALM)和随机光学重建显微镜(STORM)能够区分相距20纳米的目标，并在单个分子尺度上产生荧光照片。这些技术给了研究人员前进的翅膀。例如，美国耶鲁大学的贝沃斯多夫实验室正在“拍摄”活细胞表面移动的蛋白质。

从2006年到现在的10年间，这三项技术掀起了技术和方法创新的浪潮。2014年，德国马克斯·普朗克研究所生物物理和化学研究所的斯特凡·赫尔、美国霍华德·休斯医学院詹利亚农场研究所的埃里克·白兹格和美国斯坦福大学的威廉·摩尔纳提出了突破衍射极限的成像策略，使他们成为诺贝尔化学奖获得者。研究人员目前正在制造更亮的荧光探针来照亮细胞过程，这在人类面前是没有的。

"令人兴奋的是，这些技术使得观察活细胞成为可能."詹妮亚农场研究所的珍妮弗·利平科特-施瓦茨说，“目前，使用荧光探针来拍摄单个蛋白质的时机已经成熟。”

更耐用、更明亮

这三种超分辨率显微技术依靠绿色荧光蛋白等化合物发光。这些物质的基因可以插入编码细胞蛋白质的基因中。然后，荧光物质附着在产生的蛋白质上，并通过发射荧光显示它们的存在位置。

然而，这些技术都有局限性。一个大问题是这些探针只能发出非常有限的光，直到它们被激发它们发光的激光完全破坏。甚至在光衰减效应出现之前，探测器的光就非常微弱。

这些探针的集成版本，有机染料，可以发出更亮的光，但不能编码目标基因并将其插入细胞。相反，它们通常与能找到蛋白质的抗体结合。然而，这种结合使得探针太大而不能穿过细胞膜或干扰蛋白质功能。"这些探测器确实有局限性。"贝沃斯多夫说。

幸运的是，创新正在出现。贝沃斯多夫的团队正与两个团队合作研究可点击的化学探针:新英格兰生物实验室的SNAP标签和普洛马格生物技术公司的卤标签。这些技术包括可以编码到目标蛋白质中的短靶序列和可以通过简单的化学反应嵌入到靶蛋白质中的染色分子。Bewersdorf和他的同事已经证明了这两种技术可以使用有机染料作用于活细胞。

此外，研究人员转向了量子点——纳米级半导体。这种物质不仅明亮，持续一个月甚至更长时间，而且可以与生物分子结合。新墨西哥大学的生物物理学家黛安·李克在细胞传导实验中使用了量子点。然而，量子点有一个缺点:它们太大了。市场上所有的量子点都有一个外壳，这使得它们的直径为15-25纳米。与只有4纳米宽的荧光蛋白相比，“它们太大太重了。”

这一缺点意味着研究人员很难将量子点放置在细胞或其他紧凑的空间中，但它们可以有效地应用于细胞外基质和膜结合蛋白。与她的丈夫、学校物理学家基思·李克合作，李克开发了一种多色、快速、单分子跟踪技术，可以在定制的显微镜中使用量子点产生图像。

开放单元

穿过细胞膜是荧光显微镜面临的最大障碍之一。“即使只有5纳米厚，细胞膜也已经进化了数十亿年，将细胞内外隔离开来，效果惊人地好。”伊利诺伊大学香槟分校的生物物理学家Paul Selvin说。

塞尔文的实验室已经开发出更小的量子点，直径接近9纳米。这种尺寸允许他将量子点滑过神经细胞之间20-40纳米的间隙，信息传导分子通过这些间隙将信息传递给邻近的神经细胞。一旦进入，量子点可以结合并突出有助于记忆形成的受体的存在。尽管塞尔温没有将这些量子点植入活细胞，但他认为这是可行的。

实验室还计划在细胞膜上打孔，并快速密封，以避免损伤细胞。“我们可以用一种叫做链球菌溶血素的细菌酶在细胞膜上钻一个大约5纳米的小洞。”塞尔温说。这个宽度足以让荧光蛋白通过，甚至是与抗体结合的蛋白，以便找到细胞内的目标物体。之后，研究人员能够用未公布的方法在20分钟内修复这些洞。

此外，有人担心这些探针会干扰靶蛋白的功能。然而，来自肖杰约翰·霍普金斯大学的生物物理学家提出了一种不会破坏这些蛋白质的替代方案。

她的探针分子经过基因改造，不会附着在目标分子上。一旦它们被制造出来，它们立即被酶切割并进入细胞膜上的特定位置。这意味着它们不再携带目标分子的位置信息，而是位于可以精确计算它们的位置，从而获得蛋白质生产的精确计数，同时蛋白质本身可以*发挥功能。肖称这种技术为裂解共转化激活(CoTrAC)。

"量化活细胞的蛋白质水平是非常重要的."肖解释说:“人们通常用荧光来表示相对变化。”然而，研究的基因调控蛋白非常少，并且难以使用超分辨率计数成像。此外，这些蛋白质确切数量的细微变化也能决定细胞状态是否发生了变化。

让背景变暗。

除了变得更亮之外，另一种让探头突出的方法是降低背景亮度。德国波恩大学的生物物理化学家乌尔里希·库比察克说，“细胞中的扩散也有其背景。”非目标蛋白质甚至具有自然和暗淡的荧光，这导致背景噪音。如果降低背景噪声，图像的清晰度将会提高。

因此，研究人员不断改进他们的亮度策略。Kubitscheck实验室使用激光层显微照相术产生非常精细的精确聚焦光束，可以从侧面穿过样品。"我们在下部和周围建造了一些透明的玻璃室."他说。通过从侧面而不是顶部照亮样品，该团队照亮了200-300纳米厚的切片，并从底部观察样品。科学家用这种方法来观察核糖核酸分子通过一种叫做核膜孔的蛋白质复合体输出并进入细胞质。在这里，它们开始指导蛋白质合成。

能够对激光层成像的显微镜已经商业化。一个具有专业知识的研究团队已经成立，并开始定制自己的显微镜。

下一代选择性平面照明显微镜，称为点阵光显微镜，诞生于贝兹格的实验室。詹利亚农场研究所的细胞生物学家和项目合作伙伴刘哲说，这项技术可以产生厚度为300-500纳米的照明平面，其优势在于光点的结构。晶格能形成一个三维网格来照亮样品的连续部分。

总之，显微镜在生物学发展中非常重要，尤其是早期显微镜领域的一些重要发现，直接推动了细胞生物学及相关学科的突破性发展。随着生命科学研究从整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及其识别精细细节的能力已经成为关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。(张张)

中国科学新闻(2016-07-05第三版国际版)

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