《自然》文章盘点关于基因“剪刀”的五大谜题

原核生物使用CRISPR-Cas来抵抗在细胞图谱上形成结构的病毒。资料来源:苔莎

这是一个非常棒的工具。我想知道这个系统从头到尾是如何工作的。

Francisco Mojica不是第一个看到CRISPR的人，但他可能是第一个被它迷住的人。他仍然记得1992年的那一天，当时他第一次瞥见了可能引发生物技术革命的微生物免疫系统。他正在评估地中海嗜盐细菌的基因测序数据，发现了14个不同寻常的DNA序列，每个序列有30个碱基。他们的前后读数大致相同，每次重复大约35个碱基。很快，他看到了更多类似的现象。莫吉卡因此涉足这一领域，使重复序列研究成为他在西班牙阿利坎特大学的研究重点。

这不是一个受欢迎的决定。他的实验室已经连续几年没有得到资助了。在会议上，莫吉卡将抓住机会抓住任何他能找到的大人物，并问他们如何看待这个奇怪的小序列重复。“不要太注意重复。”他们总是这样警告他。“在许多有机体中有许多重复。我们已经认识他们好几年了，但我们不知道他们大多数是如何工作的。”

今天，人们对这一簇有了更多的了解，也就是周期性短回文的重复序列，它被命名为CRISPR，帮助CRISPR-Cas微生物免疫系统消灭入侵的细菌。然而，尽管生物医学领域的大多数人已经开始害怕这个系统的运行机制，尤其是一个叫做CRISPR-Cas9的版本，因为它可以用来编辑基因，Mojica和其他微生物学家仍然对这个系统的一些基本问题和它如何工作感到困惑。它是如何进化的？它如何影响微生物的进化？为什么有些微生物使用它，而有些不使用？它在基础生物学方面还有其他突出的优势吗？

它从哪里来？

像CRISPR-Cas这样的生物优势非常明显。原核生物(细菌和鲜为人知的称为古细菌的单细胞生物)不断受到基因入侵者的挑战。病毒的数量远远超过原核生物，比例为10:1，每两天杀死世界上一半的细菌。原核生物也交换DNA废物:质粒。它们可能是寄生的——如果宿主试图驱逐“搭便车者”，它们会耗尽宿主的资源，迫使宿主自杀。似乎没有安全的地方:从土壤到海洋到地球上最荒凉的地方，基因入侵者无处不在。

原核生物已经进化出大量的武器来应对这些威胁。但是这些防御有点慢。每一种酶都被编程来识别一个特定的序列，只有当一种微生物获得了它所争夺的基因的拷贝时，它才能得到保护。CRISPR-Cas更具活力。它可以适应和记忆特定的基因入侵者，就像人类抗体在感染后提供长期免疫一样。"当我们第一次听到这个假设时，我们认为这个方法对于简单的原核生物来说可能太复杂了。"荷兰瓦克宁大学的微生物学家约翰·范德·奥斯特说。

莫吉卡和其他人在发现克里斯普回文重复序列之间的空间中的DNA有时与病毒基因组中的序列相匹配时，推断出了克里斯普-卡斯的功能。此后，研究人员开始开发与CRISPR相关的特定蛋白质，并在细菌和古细菌接触特定病毒或质粒后，将这些间隔序列添加到基因组中。来自这些间隔区的核糖核酸将指示其他Cas蛋白质吞下任何入侵的DNA或与序列匹配的核糖核酸。

它是如何工作的？

近年来，关于Cas蛋白互补间隔区的许多分子细节已被详细了解，但病毒DNA在化学上与宿主DNA相似。这些蛋白质如何知道在携带DNA的细胞中，哪些DNA应该被添加到CRISPR-Cas记忆中？

风险非常高:如果一个细菌添加了自己的一部分DNA，它会因为主动免疫系统的攻击而自杀。立陶宛维尔纽斯的一名大学生化学家维吉妮尤斯·斯克尼斯说，“这些酶是一把双刃剑。”

北卡罗来纳大学的微生物学家鲁道夫·巴伦古说，这可能是因为细菌和古细菌群体能够吸收某些错误。如果其他细胞在病毒攻击后能够繁殖，那么一些细胞的自杀可能并不重要。

事实上，当一种病毒侵入细菌生态系统时，通常一千万个细菌中就有一个获得了自我防御空间。这种可能性使得很难研究是什么驱动了间隔区的识别，也很难理解为什么另一个细胞会在其他细胞失败后继续存在。"当它真的发生时，很难抓住那些细菌."纽约洛克菲勒大学的微生物学家卢西亚诺·马拉菲尼说。

它还能做什么？

一些间隔物的起源是另一个难题。到目前为止，不到3%观察到的间隔区与DNA数据库中的任何已知序列相匹配。

这反映出人们对这种病毒的了解是多么少。大多数测序工作集中在受感染的人、牲畜或农作物上。"我们对细菌的敌人知之甚少，尤其是疯狂古菌的敌人."雅典乔治亚大学的核糖核酸生物学家迈克尔·特恩斯说。

也有可能一些间隔物是不再存在的病毒的幽灵，或者变异成无法区分的病毒。但是第三种可能性也是一个热门的研究领域。研究人员发现CRISPR-Cas系统不仅仅是阻止基因进入人群的一个例子。在一些细菌中，CRISPR-Cas成分控制着DNA修复、基因表达和生物膜形成。他们还能确定一种细菌感染其他细菌的能力:嗜肺军团菌能引起军团病，而且它们必须含有Cas蛋白Cas2，从而感染其自然宿主变形虫。"一个主要问题是有多少生物失去了防御."麻省大学医学院的分子生物学家埃里克·桑特海默说，“在未来几年里，这将是几只‘靴子’登陆的地方。”

为什么只有一些微生物使用它？

不管CRISPR-Cas有什么其他功能，很明显，一些微生物比其他微生物更可能使用它。库宁说，超过90%的古细菌具有基于CRIPSR的免疫力，而只有1/3的测序细菌具有这种免疫力。没有发现非原核生物甚至单细胞生物存在CRISPR-Cas。

其中一个古细菌，叫做nagua，就像一种寄生生物，生活在靠近沸水的另一个古细菌上，分布着许多与能量生产和传统细胞管理相关的基因。然而，在490，000个DNA字母的小世界中，那瓜在CRIPSR-Cas系统上有大约30个区室。"其基因组的很大一部分致力于CRISPR . "英国圣安德鲁斯大学的分子生物学家马尔科姆·怀特说，“CRISPR一定非常重要，但我们不知道为什么。”

埃克塞特大学彭林分校的微生物学家埃德兹·韦斯特拉说:“这种差异表明，有一些关键的生态因素支持CRISPR-Cas系统，并且比细胞自杀的风险更重视病毒防御或其他益处。”。极端环境似乎支持CRISPR-Cas系统，但韦斯特拉强调，类似系统的出现频率也将显示更适宜居住环境中细菌的一些变化。例如，当禽类病原体鸡毒支原体的宿主从鸡变成野生雀时，它将失去其CRISPR-Cas设备。然而，韦斯特拉说，尚不清楚为什么该系统对鸡有效，但对野鸟无效。

有多少CRISPR-Cas类型？

研究人员已经正式确定了6种不同的CRISPR系统，包括19个亚种。"事实上，我们只知道其中一小部分在工作。"马拉菲尼说。

解开这些机制可能会导致使用CRISPR-Cas系统的新生物技术的发现。例如，科学家喜欢的CRISPR-Cas9属于系统二，它利用间隔序列转录的核糖核酸分子来引导酶切断入侵的病毒或脱氧核糖核酸质粒。

系统三是自然界中最常见的CRISPR-Cas系统，也是知识最少的系统。到目前为止，证据表明，它们对脱氧核糖核酸或核糖核酸本身没有反应，而是对将脱氧核糖核酸翻译成核糖核酸的过程有反应。其他系统也可能会突然出现，尤其是当研究人员将他们的研究范围从培养皿扩展到包括环境DNA样本的基因测序时。

对Mojica来说，探索这种多样性并回答关于CRISPR系统的基本问题比它们引发的革命更有吸引力。“我知道这是一个非常棒的工具。太棒了。它可以用来治疗疾病。”莫吉卡说，“但这不关我的事。”我想知道这个系统从头到尾是如何工作的。”(《晋南编》)

《中国科学日报》(2017-023，第三版国际版)

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