纳米孔测序技术有望颠覆DNA测序市场

斯科特·蒂格(左)和其他研究人员使用迷你仪器对南极洲泰勒谷的微生物DNA进行测序。

资料来源:莎拉·约翰逊

克里斯托弗·梅森有一种他喜欢在会议上展示的技能。通过从志愿者手机上采集的测试样本中提取DNA，他和他的同事可以在一小时内现场进行谱系分析，甚至可以详细描述捐赠者的日常生活细节。“我们可以通过手机上的残留物来预测谁刚吃了一个橘子，谁吃了猪肉。”美国纽约威尔康奈尔医学院的计算生物学家梅森说。

他通过使用牛津纳米孔技术公司(ONT)开发的名为MinION的手持测序设备实现了这种快速分析。MinION通过让长的DNA链穿过称为纳米孔的小孔，并检测由DNA的四种核苷酸成分引起的电流的微小变化来读取序列信息。尽管梅森的演示很容易解释该设备的性能，但早期用户也积累了一些显著的科学成就。MinION在2015年埃博拉疫情监测中发挥了重要作用。他航行到了南极，甚至进入了太空轨道。

然而，一张扑克牌大小的MinION在全球测序市场上只占很小的份额。这个市场仍然由加州圣地亚哥的启蒙公司主导。尽管教化已经引导了近10年，但ONT及其用户也在努力克服技术挑战——最突出的挑战是高错误率。同时，有竞争力的企业希望对这种概念简单、技术复杂的排序策略稍加创新，以超越ONT。

最受传染病研究者的欢迎

事实证明，MinION在传染病研究者中特别受欢迎。例如，伯明翰大学的微生物遗传学家尼古拉斯·罗曼(Nicholas Loman)是MinION的早期采用者，他与全球病毒“热点”的同行合作，共同监控埃博拉在西非和巴西兹卡的传播。“他们基本上可以在48小时内建立并运行一个测序实验室，他们还可以将设备装进手提箱里，以便携带。”加州大学的生物物理学家Mark Akeson说。阿克森已经对纳米孔测序进行了一些基础研究，并且是ONT咨询委员会的成员。洛曼说，这种便携性是一个巨大的优势，但大量的数据输出可能难以控制。"我们在巴西几乎成功了，但是我的苹果电脑因为过热而崩溃了."

一些团队正在探索临床微生物学的应用。澳大利亚昆士兰大学的生物信息学专家拉克伦·科因开发了一种实时数据分析算法来检测血液样本中的耐药细菌。在使用培养细菌的早期测试中，硬币小组能够在10小时内识别样本中的所有抗药物基因。科恩说，目前的技术可以让这一次减半，但是使用真实的样本(人类的DNA会淹没细菌的DNA)使这一过程变得复杂。“我认为再过一年左右，我们将能够在6小时内识别出患者样本中的抗药基因。”

其他研究人员正在探索宏基因组学，目的是全面描述样本中的所有生物体。原则上，流动细胞中的每个纳米孔可以用来同时检测不同的基因组。"你可以得到任何现存物种的完整遗传图谱——细菌、病毒和人类DNA . "梅森说。他利用纳米孔测序对纽约臭名昭著的肮脏地铁系统进行了宏基因组调查，并雄心勃勃地计划分析更荒凉的环境，包括火星。梅森与美国宇航局科学家的合作证实了迷你机器人在国际空间站零重力条件下表现良好。他和他的同事希望有一天这项技术能被用来研究火星，并为正在进行的寻找外星生命提供帮助。

回到地球，佛蒙特大学的遗传学家斯科特·泰格在南极洲的麦克默多根山谷经营迷你酒吧。在那里，他的团队花了两个多小时对微生物样本进行测序。“设备停止运转的原因是因为外面太冷:最后电池没电了。”梅森解释说，他曾在几个项目上与蒂格合作。

瞄准哺乳动物基因组

纳米孔领域的资深专家，如国家人类基因组研究所所长亚当·菲利普，认为微生物基因组组装是“一个已解决的问题”。今天，他们有一个更高的目标:一个包含数十亿而不是数百万核苷酸的哺乳动物基因组。今年，加拿大安大略癌症研究所的生物信息学专家菲利普、洛曼和辛普森等研究团队报告说，他们只用MinION的数据就高精度地组装了一个完整的人类基因组。辛普森说，重叠组的平均大小达到了100万碱基的水平，最高精度为99.44%。该团队通过使用启迪公司的短序列技术将准确率提高到99.96%，尽管这仍然落后于99.99%的黄金标准准确率。

然而，在人类基因组分析的其他方面，纳米孔做得更好。例如，人类基因组的当前装配仍然不完整，因为高度重复的区域对于短序列分析来说是“不冷的”。由加州大学基因组学研究员卡伦·米加领导的团队证实，纳米孔可以帮助研究人员填补这些空白。Miga团队利用150千碱基对的序列重建了人类着丝粒，这是真核生物染色体上高度复制的基因组。这个领域的研究以前是空白的。与Miga合作的阿克森预测，只有几年时间，真正完整的基因组序列才能组装完成。

纳米孔分析也非常适合绘制外部基因标记——对单个核苷酸的微小化学修饰将影响基因表达。大多数测序平台使用去除这些标记的样品制备方法，但是纳米孔平台可以直接分析修饰的DNA。约翰·霍普金斯大学的辛普森和温斯顿·蒂姆证实，他们可以训练软件来区分甲基化的胞苷酸和正常的胞嘧啶电信号，准确率约为90%。阿克森也取得了类似的成功。"我们可以检测到我们试图看到的任何变化."阿克森说，“它甚至可以区分两个氢原子之间的差异。”

更多期望

然而，一些用户发现纳米孔样品制备工具是不可预测的。例如，一些DNA样本需要广泛的优化。"有些人做得非常好，取得了惊人的成绩，但其他人仍在努力奋斗。"总部位于马萨诸塞州的药物研发公司曲速生物的首席科学家基思·罗宾逊说。在去年12月的一次演讲中，ONT首席技术官克莱夫·布朗宣称:“该公司正在付出大量努力，为人们提供特定样本类型的调试协议，以帮助他们优化获得的样本。”

许多问题给竞争对手带来了机会。紧随其后的是瑞士的罗氏公司。2014年，该公司收购了一家位于加州的纳米微孔初创公司Jania Technology。尽管罗氏公司对其系统保密，但雅妮亚在2016年发布的一份文件中描述了“通过合成对纳米孔进行测序”的策略。这项技术将DNA合成酶与蛋白质纳米孔相匹配。这种酶读取目标DNA，并使用带有化学标签的核苷酸来产生互补序列。当每个碱基都包含在不断延伸的DNA链中时，它的标签就会被释放出来，并穿过纳米孔，从而产生不同的电信号。

然而，ONT并没有停止。与以前的型号相比，它的两个最新的桌面系统可以传输更多的数据。今年3月发布的GridION基本上可以并行运行多个MinION设备。相比之下，PromethION使用完全不同类型的移动细胞，并瞄准人类基因组规模的项目。"显然，他们希望这个系统在输出上能与启蒙运动的平台相媲美."罗曼说。

尽管在这个领域已经取得了很大进展，但不可否认的是，纳米孔测序占据了主导地位。低成本和可靠测序的前景激发了研究人员。"作为一名计算机科学家，我总是渴望得到数据."菲利普说，“所有微生物实验室和大学教室都能产生测序数据的想法非常吸引人。”(宗华编译)

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