施一公等报道酿酒酵母剪接体处于完成RNA剪接后构象的高分辨率电镜结构

2017年11月17日，清华大学生命研究所和结构生物学高级创新中心的施一公教授研究团队在《细胞》杂志上再次发表了关于剪接体结构和机制的最新成果。这篇题为“酿酒酵母催化后剪接的结构”的论文报道了酿酒酵母剪接在核糖核酸剪接反应后呈现一种状态(定义为“P复合物”)，D结构的总分辨率为3.6埃，首次显示了前信使核糖核酸中3’剪接位点的识别状态。该结构为回答关键问题提供了重要的结构信息，如在核糖核酸剪接反应中如何识别前核糖核酸中的3’剪接位点，酯交换反应如何在第二步发生，以及成熟的核糖核酸如何释放。

1977年，科学家第一次发现腺病毒的mRNA及其相应的DNA转录模板不能形成连续的杂交双链，而是在杂交双链的不同位置延伸出环状的DNA单链。这一重大发现表明，遗传信息从脱氧核糖核酸到核糖核酸的转移不仅是通过转录，而且是通过前核糖核酸的剪接来进一步完成“无效”遗传信息的去除和有效遗传信息的剪接。“无效的”遗传信息没有翻译功能，称为内含子，而能被核糖体翻译的有效遗传信息称为外显子。内含子去除和外显子连接的过程称为核糖核酸剪接。核糖核酸剪接在真核生物中很常见。随着物种的进化，含有内含子的基因数量增加，RNA剪接的频率也相应增加，使得一个基因编码多个蛋白质成为可能，极大地丰富了蛋白质组的多样性，是真核生物多样性的重要原因之一。

RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一。负责执行这一过程的人是一个巨大且高度动态的分子机器——细胞核中的接合体。从1977年首次发现核糖核酸剪接到本世纪初，科学家已经初步建立了剪接体的组装和解聚过程，以及复杂的核糖核酸剪接调控网络，如蛋白质和蛋白质、蛋白质和核酸之间的相互作用和调控，通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱和体外剪接反应系统的建立。核糖核酸剪接的本质是两步酯交换反应。在剪接反应期间，多种蛋白质-核酸复合物和剪接因子根据高度精确的序列被结合和解聚，以形成预组装的复合物U4/U6。U5tri南部(U4/U6。U5核核糖核蛋白复合物)和至少7种状态的剪接体B、Bact、B*、C、C*、P和ILS复合物(图1)。

图1 RNA剪接示意图

(照片来源:shiy . nature reviews molecular cell biology，2017。)

然而，由于剪接体蛋白质和核酸的多样性、大分子量和各种动态结构，该领域的进展相对缓慢，获得高分辨率的剪接体三维结构是世界公认的问题。2015年，石研究组率先突破并在世界上首次报道了酿酒酵母剪接体的3.6埃高分辨率结构和剪接体催化中心的近原子分辨率结构。这一重要的研究成果对RNA剪接机制的研究具有革命性的影响。自2015年第一个拼接体结构发表以来，石研究组先后分析了5个不同状态的拼接体复合体，即预组装复合体U4/U6的高分辨率结构。酿酒酵母的U5三核苷酸，3.5埃的活化复合物细菌复合物，第一次催化反应后的3.4埃的复合物C复合物，第二次催化活化状态下的4.0埃的C*复合物，以及3.5埃内含子套索剪接体的ILS复合物的结构。这些分解的剪接体基本上覆盖了整个核糖核酸剪接周期，解释了剪接体是如何组装的工作机制，它们是如何被活化的，第一次酯交换反应是如何发生的，以及剪接体在核糖核酸剪接后是如何解聚的然而，在第二步中如何调节和发生酯交换反应需要捕获最关键的剪接状态，即催化后剪接，即磷复合物。

与以上分析的多种状态下的拼接体不同，P复合体具有更高的动态性和实时性，在正常生理状态下极难捕获。在新发表的《细胞》论文中，石研究组进一步探索和优化了蛋白质纯化方案。通过在酿酒酵母中表达关键蛋白的灭活突变体，接合子不能释放成熟的信使核糖核酸，从而获得稳定的和良好表征的磷复合物样品。随后，使用单粒子冷冻电子显微镜技术重建具有3.6埃总分辨率的高分辨率冷冻电子显微镜结构，并建立原子模型(图2)。这种结构首次显示了在完成核糖核酸剪接两步酯交换反应后，剪接体的整体结构以及内部蛋白质和核酸成分的组装。可以清楚地看到，最初由内含子分开的两个外显子已经共价连接形成成熟的信使核糖核酸，并被U5核糖核酸识别和固定在接合体的反应中心。值得一提的是，在这种结构中，首次观察到前体mRNA中的3’剪接位点AG通过非经典碱基互补配对被5’剪接位点的分支点A和第一个核苷酸G识别的机制。这两个核苷酸通过碱基堆积力被5’剪接位点的G和U6核糖核酸进一步固定。因此，对结构的分析首次显示了重要的结构信息，例如3’剪接位点的识别和关键蛋白Prp22参与成熟的信使核糖核酸的释放，这为多年来关于第二次酯交换反应发生时如何识别3’剪接位点的推测和争论提供了最有效的结构证据。

图2酿酒酵母催化的剪接体的三维结构

清华大学教授和石的研究团队致力于捕捉RNA剪接过程中处于不同动态变化的剪接体的结构，从而从分子水平解释RNA剪接的工作机制。到目前为止，石研究小组已经分析了酵母中7个不同状态的剪接体的高分辨率三维结构(如图3所示)。从预组装到活化，从两步酯交换反应到剪接体的解聚，这七种状态的剪接体基本上覆盖了整个剪接途径。剪接体介导的核糖核酸剪接过程首次串联起来，为理解核糖核酸剪接的分子机制提供了最清晰和最全面的结构信息。由于他对核糖核酸剪接的重要贡献，施一公教授不久前获得了未来科学奖的生命科学奖。

图3石课题组分析的酵母碎片结构概述

(照片来源:石实验室)

清华大学生命研究所和结构生物学高级创新中心的施一公教授是本文的通讯作者。清华大学生命科学研究所三年级博士生、生命科学研究所博士后阎传业、结构生物学高级创新中心优秀学者万和医学院五年级博士生。清华大学冷冻电子显微镜平台的雷建林博士为冷冻电子显微镜的数据采集提供了帮助。电子显微镜数据收集自清华大学冷冻电子显微镜平台，计算得到清华大学高性能计算平台和国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的支持。这项工作得到了北京结构生物学高级创新中心和国家自然科学基金的支持。

原始链接:

http://www . cell . com/cell/full text/S0098674(17)31263