结构生物学领域迎来“不结晶”革命

如果继续发展下去，所有的技术问题都解决了，冷冻电子显微镜将真正成为一种主导技术，而不仅仅是首选。

资料来源:维克多·科恩

在英国剑桥的一座钢结构建筑的地下室里，一场大规模的“*”正在上演。

一个大约3米高的巨大金属盒子正通过屋顶上消失的厚橙色电缆悄悄放出数兆字节的数据。这是世界上最先进的冷冻电子显微镜之一:一种利用电子束对冷冻生物分子成像并揭示其分子形状的设备。英国医学研究委员会分子生物学实验室(LMB)的结构生物学家舍斯·舍尔斯(Sjors Scheres)站在500万英镑(770万美元)的设备旁，像个侏儒一样，说显微镜太灵敏了，一声喊叫就能毁掉实验。

在全球实验室中，像这样的冷冻电子显微镜正在影响结构生物学领域。在过去的三年里，他们已经揭示了制造蛋白质的核糖体的细节，这些发现正以极快的速度发表在*杂志上。结构生物学家毫不夸张地认为，他们的领域正在发生一场革命:冷冻电子显微镜可以快速创建高分辨率的分子模型，抵抗x光结晶学和其他方法。与此同时，使用先前技术获得诺贝尔奖的实验室正在争相学习这种“暴发户”方法。

挑战“国王”

当生物学家理查德·亨德森1973年来到LMB研究一种叫做细菌视紫红质的蛋白质时，利用光能推动质子穿过细胞膜的x光结晶学无疑是“王者”。亨德森和他的同事奈杰尔·昂温用这种蛋白质来制造二维晶体，但是它们不适合用于x光衍射。因此，两人决定试试电子显微镜。

当时，电子显微镜被用来研究用重金属染色剂处理过的病毒或组织切片。一束电子射向样品，在样品中检测到*电子，并用来描述它们撞击的材料结构。这种方法产生了第一张清晰的烟草细菌图像，但是污渍使得观察单个蛋白质变得困难，更不用说x光所揭示的原子细节了。

关键的一步是，当亨德森和安文用电子显微镜对细菌视紫红质晶片成像时，他们省略了染色，而是将晶体放在金属网格上以突出蛋白质。"你可以看到蛋白质中的原子。"亨德森在1975年发表了昂温的细菌视紫红质结构，他说。“这是向前迈出的一大步。”旧金山加利福尼亚大学的细胞生物学家大卫·阿加德说，“也就是说，用电子显微镜研究蛋白质结构是可能的。”

冷冻电子显微镜的领域发展于20世纪80年代和90年代。一个关键的进步是使用液态乙烷瞬间冷冻溶液中的蛋白质并保持它们静止不动。然而，在正常情况下，这种技术只能以10埃的分辨率分析蛋白质结构(1埃相当于1纳米的1/10)，这与x射线结晶学超过4埃的模型不相竞争，并且远不能满足在药物设计中使用这些结构的要求。当像美国国家卫生研究院这样的捐赠者在雄心勃勃的晶体学项目上投资数亿美元时，冷冻电子显微镜的资金就远远落后了。

1997年，当亨德森参加一年一度的戈登三维电子显微镜研究会议时，一位同事在开幕式上发表了一个挑衅性的声明:冷冻电子显微镜是一种“利基”方法，不能取代x射线结晶学。然而，亨德森看到了一个不同的未来，并在随后的演讲中予以反驳。“我当时说过，我们应该让冷冻电子显微镜主宰世界上所有的结构方法。”他回忆道。

革命从那时开始。

在接下来的一年里，亨德森、阿加德和其他冷冻电子显微镜的热心支持者系统地实现了各种技术进步，尤其是找到了一种更好的检测电子的方法。在数码相机在世界上流行了很长一段时间后，许多电子显微镜专家仍然更喜欢过时的胶片，因为它比数字传感器能更有效地记录电子。然而，与显微镜制造商一起，研究人员开发了新一代直接电子探测器，远远超过胶片和数码相机探测器。

这些探测器应用于2012年前后，能够以每秒几十帧的速度捕捉单个分子的快速图像。与此同时，像舍尔斯这样的研究人员已经编写了复杂的软件程序，将数以千计的2D图像转换成三维模型，在许多情况下，这些模型的质量可以与结晶学分析的分子图像相媲美。

冷冻电子显微镜适用于稳定的大分子，它们可以承受电子轰击而不会晃动，因此通常由几十种蛋白质组成的分子机器是一个很好的目标。研究证明，没有什么比核糖核酸缠绕支持的核糖体更合适了。用X射线结晶学分析核糖体结构的方法为三位化学家赢得了2009年诺贝尔化学奖。在过去的几年里，不同的研究小组已经迅速发表了许多生物的核糖体冷冻电镜结构，包括第一个人类核糖体高分辨率模型。在由分享2009年诺贝尔奖的文基·罗摩克里希南领导的LMB实验室里，x光结晶学在很大程度上被忽视了。他认为，对于大分子来说，“预测冷冻电子显微镜将大大取代结晶学是可靠的。”

今年5月，加拿大多伦多大学的结构生物学家约翰·鲁宾斯坦和他的同事们使用了大约10万张冷冻电子显微镜图像，创建了一种叫做V-ATPase的“分子膜”，这是一种形状像转子的酶。三磷酸腺苷酶通过燃烧三磷酸腺苷将质子推入和推出细胞液泡。"我们看到的是一切都在灵活地进行着。"鲁宾斯坦说，“它在弯曲、扭曲和变形。”在他看来，这种酶的灵活性能有助于它有效地转移三磷酸腺苷释放的能量。

主导结构生物学领域

像任何新兴领域一样，冷冻电子显微镜领域也有其成长的烦恼。一些专家担心，竞相使用这项技术的研究人员将会产生有问题的结果。科学家对2013年发表的一种艾滋病毒表面蛋白的结构提出了质疑。他们认为用来建立模型的图像是白噪声。从那以后，尽管其他团队制作的x光和冷冻电子显微镜模型挑战了原始模型，但这些研究人员一直坚持他们的结果。

今年6月，在戈登会议上，希望加强质量控制的研究人员通过了一项决议，敦促期刊向评论者提供关于冷冻电子显微镜结构是如何形成的详细信息。

成本也会减缓这项技术的传播。根据舍尔斯的估计，LMB每天花费大约3000磅来操作其冷冻电子显微镜设备，外加1000磅电力。大多数电费账单是由存储和处理图像所需的计算机产生的。"对许多实验室来说，这是一笔非常高的开支."

为了让冷冻电子显微镜的使用更方便，一些赞助商设立了共享设备，让研究人员可以预留时间。霍华德·休斯医学研究所(HHMI)在弗吉尼亚州的农场经营一个冷冻电子显微镜实验室，对HHMI资助的研究人员开放。在英国，由*和韦尔科姆基金会资助的国家冷冻电子显微镜设备今年已经在牛津附近的迪德科特投入使用。"人们想知道冷冻电子显微镜，这已经成为一种潮流."伦敦大学伯克贝克学院的结构生物学家海伦·赛比尔帮助安装了这种设备，她说。

纽约洛克菲勒大学的生物物理学家罗德·麦金农也在追逐这股浪潮。他因确定特定离子通道的晶体结构而获得2003年诺贝尔化学奖，但现在他正在深入研究冷冻电子显微镜。"我在学习曲线的陡坡上，这总是让我兴奋."麦金农希望用冷冻电子显微镜研究离子通道是如何打开和关闭的。

当亨德森在1997年反驳冷冻电子显微镜将主宰结构生物学世界时，他可能是口是心非。但近20年后，他的预测并不像当时看起来那样夸张。“如果它继续发展，所有的技术问题都得到解决，冷冻电子显微镜将真正成为一种主导技术，而不仅仅是首选。”亨德森说，“我们可能已经走到一半了。”(宗华)

中国科学新闻(2015-09-22第三版国际版)

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