北大专家解读2014诺贝尔化学奖

今年的三位诺贝尔化学奖获得者打破了光学成像中长期存在的衍射极限，将荧光显微成像的分辨率带入了“纳米时代”，给生命科学研究带来了巨大的变化。

孙玉杰(北京大学生命科学学院生物动力光学成像中心研究员)

10月8日，2014年诺贝尔化学奖揭晓，美国科学家埃里克·白兹格、威廉·默纳和德国科学家斯特凡·赫尔因他们在超高分辨率荧光显微镜领域的贡献而获奖。正如官方的获奖论文所描述的那样，尽管这种技术仅用了十多年就在科学研究中发挥了作用，但它已经显著地促进了许多领域的发展，并且可以预测它将在未来给生命科学研究带来巨大的变化。

什么是超高分辨率荧光显微镜

人眼通常能看到至少约0.1毫米，而生物的基本单位——细胞的平均直径约为20微米或0.02毫米，因此观察生物的微观世界需要使用光学显微镜。光学显微镜有许多优点，不仅可以放大微观世界，而且对样品没有损伤，并且可以专门观察目标物体。这种特异性通常通过荧光显微镜来实现。荧光是物质吸收光后发出的光。通常，发射光的波长比吸收光的波长长。因此，可以分别检测荧光，以实现对目标的高灵敏度检测。然而，光学显微镜的分辨率是有限的。由于光的衍射，当被透镜成像时，即使是极小的光斑也会形成漫射图案，通常称为“艾里斑”。这样，即使两个目标点相距很远，它们的散射点也可能很近，以至于无法区分。

基于这一原理，早在1873年，德国科学家恩斯特·阿贝就提出了阿贝的光学衍射极限，这是刻在他墓碑上的一项重要成就。根据这个公式，光学显微镜的分辨率约为探测光波长的一半，约为300纳米(可见光的波长为400-700纳米)，或我们头发直径的1/300。超高分辨率荧光显微术通过一系列物理原理和化学机制“突破”了这一衍射极限，将光学显微术的分辨率提高了数十倍，使我们能够以前所未有的视角观察生物微观世界。

为什么生物学研究需要超高分辨率荧光显微镜

许多亚细胞结构是微米到纳米尺度的。衍射极限的存在限制了我们用光学显微镜观察这些生物样品。例如，细胞的细胞骨架蛋白微丝非常致密，荧光显微镜下图像非常模糊，看不到细节，而电子显微镜的分辨率可达1毫米左右，非常清晰地显示细胞骨架的细节。然而，电子显微镜很难制作活体样品，其特异性不如荧光显微镜。因此，超高分辨率荧光显微术的发展对生物学研究具有重要意义。

超高分辨率荧光显微镜的发展

目前，超高分辨率荧光显微技术可大致分为三类，包括受激辐射损失、结构光照明技术和单分子技术。它的历史可以追溯到20世纪80年代。这次获得诺贝尔化学奖的三位科学家是这方面的先驱。

超高分辨率荧光显微术的发展分为三个阶段。1994年，获奖的德国科学家斯特凡·海尔当时还是博士后。他首先提出了受激辐射损失法(STED)来打破光学衍射极限，并最终在2000年通过实验实现了这一点。它利用类似激光产生的受激辐射原理，在用来激发荧光的激光点外面包裹一个类似甜甜圈的激光点。环形激光器可以抑制其区域内的荧光分子发射荧光，从而通过连续减小环形的孔径可以获得小于衍射极限的荧光发射点，并且通过扫描可以实现超高分辨率图像，从而将光学显微镜的分辨率提高近10倍。海尔目前是德国哥廷根大学的教授和德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的主任。自2000年以来，他不断改进STED技术，使其更适合生物研究。此外，他还通过类似原理发明了一系列超高分辨率技术，统称为可逆饱和荧光跃迁(RESOLFT)，为超分辨率荧光显微成像技术的发展做出了巨大贡献。

基于结构照明原理的超高分辨率技术是由美国科学家马茨·古斯塔夫松于2000年发明的。它非常适合细胞研究，但分辨率只提高了一倍。该技术基于低频莫尔条纹可以由两个高空间频率的图案重叠形成的原理，通过分析莫尔条纹实现超高分辨率成像。不幸的是，古普塔·弗格森在2011年死于癌症，享年51岁。他英年早逝，无法分享诺贝尔奖。

超分辨率荧光显微镜是真正成熟的，并广泛用于生物研究。自2006年以来，基于随机重建原理的两种超高分辨率光学成像技术同时出现。当时，它是由三个研究小组独立发明的，即哈佛大学的庄小炜教授(随机光学重建显微镜STORM技术)、诺贝尔奖获得者eric betzig(光激活定位显微镜PALM技术)和Samuel Hess(荧光激活定位显微镜fPALM技术)。他们在原则上非常相似。它们都是基于荧光分子的光转换能力和单分子定位。通过仅控制少量随机离散的单个荧光分子一次发光，并精确定位单个荧光分子的艾里斑中心，多个图像被叠加以形成超高分辨率图像。“以时间换空间”的想法非常聪明，荧光成像的分辨率提高了约20倍。图中细胞骨架的成像分辨率接近电子显微镜。

获奖的威廉·莫纳现在是斯坦福大学的教授，也是单分子荧光技术的先驱。1989年，当他在IBM研究中心工作时，他第一次测量了世界上单个分子的光吸收。1997年，他与获得2008年诺贝尔绿色荧光蛋白化学奖的钱学森合作，发现了绿色荧光蛋白的光转换效应。埃里克·拜齐格是霍华德·休斯医学研究所的教授，也是荧光显微镜的领导者。他首先在1992年实现了近场超高分辨率荧光成像，然后在1994年提出了基于单分子信号实现超高分辨率成像的思想，并于2006年在实验中实现。值得指出的是，作为STORM超分辨率技术的发明者，庄小炜教授一直引领和推动超高分辨率显微技术的发展和应用，是过去8年来该领域最活跃的研究团队。庄小炜教授毕业于中国科技大学本科初级班。34岁时，他获得了哈佛大学的全职教授职位。40岁时，他成为美国科学院院士。

超高分辨率成像作为一种新技术，突破了光学成像的衍射极限，将传统成像的分辨率提高了10-20倍。这就像一个近视的人突然戴上合适的眼镜，成为研究细胞结构的利器。在过去的七、八年里，这些技术不断进步，并且连续实现了活细胞的多色、三维和高速成像。其生物学应用也非常广泛，包括细胞膜蛋白分布、细胞骨架、线粒体、染色质和神经元突触等。超高分辨率技术的出现引起了广泛关注。首先，它在2006年被世界著名杂志《科学》的评委们评为年度十大技术突破，然后被《自然-方法》杂志评为2008年最佳生物医学方法。在最近一期《自然-方法》10周年特刊中列出的10项技术中，超高分辨率成像和单分子技术也出现在名单上。

诺贝尔奖及其前景

就像哈勃太空望远镜被用来理解宇宙一样，人类对微观世界的理解在很大程度上依赖于光学显微镜。今年的三位诺贝尔化学奖得主打破了光学成像中长期存在的衍射极限，将荧光显微成像的分辨率带入了“纳米时代”，使我们能够更准确地观察微观世界，并为疾病研究和药物研发带来革命性的变化。它也有望为世界蓬勃发展的大脑项目提供关键支持。有趣的是，这一次的三位诺贝尔化学奖获得者都是物理学博士，而且这个奖项的结果也是典型的跨国研究。物理思想、光学技术和化学探针的结合为生物研究提供了前所未有的强大工具。这是一个典型的技术诺贝尔奖。事实上，生命科学和医学领域的大量悬念不断吸引着不同背景的专业人士加入研究团队。这种交叉整合将极大地促进生物医学研究的进展。毫无疑问，我们将在未来看到更多像这样的跨境诺贝尔奖！

作者孙玉杰博士的主要研究方向是单分子荧光和超高分辨率成像技术在细胞生物学中的应用。(原题:北京大学专家[解读] 2014年诺贝尔化学奖)