《自然》：欧洲根据已知基因序列合成新冠病毒，助力疫苗开发

当地时间5月4日，国际*学术期刊《自然》在网上发布了瑞士、德国和俄罗斯许多科研机构的研究成果“利用合成基因组学平台快速重建SARS-cov-2”，其形式为“加速文章预览”。基于已知的新冠状病毒基因序列，该团队在实验中首次通过反向遗传学在酵母中快速构建了一种活的新冠状病毒。论文中提到，反向遗传学被认为是一个不可或缺的工具，它完全改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。

来文提交人是瑞士伯尔尼大学病毒学和免疫学研究所的沃尔克·泰尔和该大学兽医学院传染病和病理生物学系的乔尔格·乔尔斯。这项研究工作早在当地时间2月21日就在预先打印好的网站BioRxiv上在线发布，没有同行评议。

值得注意的是，这是基于已知病毒基因组的病毒重建的基础研究工作。这个结果与之前的一个传言无关，“新的冠状病毒是人工合成的”。本研究在实验室构建的新型冠状病毒是在疫情爆发后，基于已发表的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。

研究小组指出，新冠状病毒的化学合成，特别是在新的爆发病毒被成功分离之前，可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒株，还可以对单个基因进行基因改造和功能表征，从而获得时间对爆发做出快速反应。

大核糖核酸病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于其大且不稳定的基因组，在大肠杆菌宿主中难以克隆和操作。该研究小组报道了一个基于酵母的合成基因组学平台，用于各种核糖核酸病毒的基因重建，包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员。

该研究小组首先测试了基于酵母的合成基因组平台在其他核糖核酸病毒(如MHV小鼠肝炎病毒)中的准确性。该团队测试了含有绿色荧光蛋白(MHV绿色荧光蛋白)的小鼠肝炎病毒A59株的基因克隆能力。结果表明，供试克隆中90%的YAC正确组装了MHV基因组，表明病毒在酵母中的组装效率很高。

正是利用这个平台，研究人员在获得合成的DNA片段后一周内改造并复活了新的冠状病毒。

具体来说，研究小组将病毒基因组分成12个片段，大小为0.5 kbp-3.4 kbp。同时，为了便于细胞培养中的血清学诊断和追踪，研究小组设计了合成的新冠状病毒来表达绿色荧光蛋白。因此，研究小组进一步将片段11分成3个含有绿色荧光蛋白序列的子片段，并插入ORF7a(开放阅读框，ORF)，因此总共有14个片段。

研究小组要求试剂公司化学合成上述14个DNA片段，于1月14日下订单，并于2月4日获得其中的12个。大肠杆菌中片段5和7的克隆存在一些问题，无法完成。然而，研究小组刚刚同时从慕尼黑的一名患者身上获得了一份新的冠状病毒样本(非典-CoV-2/慕尼黑1.1/2020/929)，他们决定使用逆转录聚合酶链反应扩增获得片段5和片段7。

通过TAR克隆，研究人员已经为所有六种新的冠状病毒构建体获得了正确组装的分子克隆。随后，使用转化偶联重组技术(TAR)，根据末端重复的序列，通过酵母的同源重组系统将这些DNA序列拼接在一起。在获得完整的病毒序列后，用T7核糖核酸聚合酶将该DNA序列转录成病毒核糖核酸，并通过电穿孔技术将该核糖核酸导入到VeroE6(猴肾细胞)中，从而使细胞被感染，并将培养细胞的上清液(包括释放的病毒颗粒)注射到其它培养基中，从而使其它细胞被感染。

研究小组接着说，“在获得新冠状病毒的合成DNA片段后，我们可以在一周内设计并复活最近流行的化学合成克隆。”病毒重组具有高效性和准确性。通常，超过90%的克隆是正确的。

值得注意的是，除了新的冠状病毒，研究小组还报道了MHV(小鼠肝炎病毒，一种冠状病毒)和MERS-Cov等。是用这种技术合成和建造的。HCov-229E和寨卡病毒的构建仍在实验中。