CRISPR基因编辑技术开启五大门派

分子科学家对CRISPR带来的潜在新技术展开了新一轮的探索。资料来源:瑞安·史努克

一旦有关于CRISPR-Cas9的报告，Addgene的工作人员会立即找到它。这家非营利公司是作者经常储存研究中使用的分子工具的地方，在这里其他科学家可以立即获得这些分子工具，或者一些科学家可以立即获得相关试剂。"在一篇热门论文发表后，我们将在几分钟内接到一个电话."马萨诸塞州剑桥公司的执行董事乔安妮·卡门说。

自2013年初以来，Addgene接到了越来越多的电话。当时，研究人员报告说，在选定的地点，人类细胞的基因组是用CRISPR-Cas9技术切片的。"征召令就是在那时发出的。"卡门说。从那以后，分子生物学家蜂拥而至，使用这种技术——一种可以前所未有地轻松改变几乎所有器官基因组的技术。迄今为止，Addgene已经向83个国家的研究人员发送了60，000个与CRISPR相关的分子工具(占其产品总量的17%)。2015年，该公司的CRFISPR相关网页被浏览超过10，000次。

目前，关于CRISPR-Cas9的绝大多数对话都集中在它治疗疾病或编辑人类胚胎的潜力上，但研究人员表示，真正的改革现在正在实验室进行。CRISPR能提供的和生物学家希望的是“特异性”:在基因组的大范围内瞄准和研究特定DNA序列的能力。编辑DNA只是这项技术的一个可用方面。科学家们正在使用这些工具来准确地将蛋白质转移到DNA目标上，从而开启或关闭基因，甚至编辑整个生物回路中的基因。他们的长期目标是了解细胞系统和疾病。

"对于分子生物学家来说，这确实是理解基因组如何工作的一个非常有力的方法."马萨诸塞州波士顿儿童医学血液学家丹尼尔·鲍尔说。"它确实增加了人们可以解决的问题的数量."南加州大学的分子生物学家佩吉·法纳姆补充道，“这很有趣。”

最近，《自然》杂志写了一篇文章，介绍了生物学家的五种细胞编辑方法，CRISPR-Cas9正在改变。

断裂剪切

CRISPR-Cas9技术有两个主要组成部分:一个是Cas9酶，它可以切割DNA像一把分子剪刀；另一种是一种小的核糖核酸分子，它能把特定的脱氧核糖核酸序列“剪成剪刀”并切断。细胞固有的DNA修复机器通常修复剪切，但错误经常发生。

然而，这给希望通过破坏基因来理解其工作内容的科学家带来了好处。基因编码是无情的:修复过程中的一个小错误将完全改变它所编码的蛋白质序列或完全停止蛋白质生产。因此，科学家可以研究当蛋白质或基因被破坏时，细胞或有机体会发生什么。

然而，也有一个不同的修复通道，它有时根据DNA模板进行修复和切割。如果研究人员有模板，他们可以在几乎任何选定的位置编辑几乎任何想要的基因序列。

旧金山加利福尼亚大学的系统生物学家乔纳森·魏斯曼(Jonathan Weissman)想知道基因编辑工具在切割人类DNA时的表现，但他们计划采用不同的方法。"我们做的第一件事就是剪断剪刀。"魏斯曼说。该团队用“死亡”案例9尝试了一些新方法。研究人员将它与激活基因表达的另一种蛋白质的一部分联系起来。一些其他的扭曲被添加进去，它们最终允许基因根据需要被打开和关闭。

从那以后，几个实验室基于这种方法发表了不同的研究结果。这种方法也吸引了麻省理工学院的合成生物学家罗恩·韦斯加入克里斯普的研究热潮。该团队在一个实验中建立了多个基因扭曲，使得构建复杂的生物回路变得更快更容易。“合成生物学最重要的目标是能够通过这些精确的回路构建复杂的行为。”韦斯说。

外成的

当遗传学家玛丽安·罗特开始她的职业生涯时，她希望找到新的医学方法，通过基因治疗来锁定这些疾病的突变基因。几年后，在荷兰格罗宁根大学医学中心工作，她决定改变自己的行动方向。她认为控制基因活动的最好方法是调整表观基因组，而不是基因组本身。

表观基因组是附着在脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸包被的蛋白质化合物(组蛋白)上的聚集体。它们可以控制DNA路径，打开或关闭导致基因表达的蛋白质。这些标记会随着时间而改变:它们会随着有机体的发展和环境的变化而增加或减少。

在过去的几年里，数百万美元被投入到这个领域，例如计算不同人类细胞中的表观遗传标记以及与大脑活动和肿瘤生长相关的遗传模式。然而，由于它们不能改变特定位点的标记，研究人员无法决定它们是否会引起生物变化。

CRISPR-Cas9将扭转局面。2015年4月，北卡罗来纳州的生物工程师查尔斯·格斯巴赫和他的同事发表了一项技术，通过剪切将表观遗传标记乙酰基添加到组蛋白中。

Rots使用锌指酶蛋白(一种相对较旧的基因编辑工具)来探索表观遗传标记的功能，现在她正在使用CRISPR-Cas9。"新工具使这个领域*化，并产生了广泛的影响。"她说。Rots说，人们过去常说重写表观遗传基因不会影响基因表达，或者两者之间的关系是巧合。"但是现在测试非常简单，很多人都加入了这个领域."她说。

代码解密

DNA表观遗传标记并不是唯一等待被解开的遗传密码。超过98%的人类基因组没有指定蛋白质的遗传密码。研究人员认为大量的DNA起着重要的作用，所以他们使用CRISPR-Cas9来理解代码是什么。

一些核糖核酸分子的编码，如小分子核糖核酸、小分子核糖核酸和长的非编码核糖核酸，被认为与蛋白质生产无关，而其他序列是“增强子”，在它们的指导下扩展基因表达。大多数与常见疾病风险相关的DNA序列位于含有非编码RNA和增强子的基因组区域。然而，在CRISPR技术出现之前，研究人员很难理解那些序列在做什么。“我们没有很好的方法来从功能上解释非编码基因组。”鲍尔说，“现在我们的实验更加复杂了。”

随着研究人员使用CRISPR-Cas9技术探索越来越多的传统DNA，可能会有更多的惊喜。然而，即使有了CRISPR-Cas9，探索这个未知领域仍然存在挑战。Cas9酶可以在核糖核酸导向的指导下切割需要编辑的地方，但这只能是当一个特定的和常见的脱氧核糖核酸序列位于切割点附近时。这将给希望让基因沉默的科学家带来一点问题，因为关键序列几乎总是在基因内部。研究人员正在探索细菌王国，寻找能够识别不同序列的Cas9酶的“亲戚”。

去年，麻省理工学院和哈佛大学附属贝尔德研究所的张峰实验室发现一个叫做Cpf1的酶家族可以扩大序列选择。然而，阿加米强调说，到目前为止，还没有发现像卡西9这样多功能的酶。将来，他希望有一整套酶可以用来瞄准基因组中的任何位点。“我们还没有到达那里。”他说。

接触灯

格斯巴赫实验室正在使用基因编辑技术作为其工具的一部分来理解细胞命运和如何操纵细胞:该团队希望有一天能在培养皿中培养组织，用于药物检测和细胞治疗。然而，CRISPR-Cas9具有永久的效果，Gersbach团队需要不时地打开或关闭基因，并且需要在组织中非常特定的位置进行。"模拟血管需要高度的控制."他说。

格斯巴赫和他的同事选择了不规则的编辑“剪刀”——Cas9，它现在可以激活基因，并添加了被蓝光激活的蛋白质。当细胞暴露在光线下时，该系统可以刺激基因表达；但是没有光，系统会停止基因表达。一个由日本东京的大学生化学家佐藤盛司领导的团队已经开发出一个类似的系统，并且在暴露于蓝光后也能激活Cas9来实现基因编辑。

通过将CRISPR技术与化学“开关”相结合，其他人也取得了类似的结果。纽约威尔基内尔医学院的癌症遗传学家卢卡斯·道希望在成年大鼠身上产生与癌症突变相关的基因，从而复制在人类结直肠癌患者身上发现的基因突变。该团队使用CRISPR-Cas9技术，用一剂强力霉素激活Cas9，切断目标。

疾病模型

从癌症到神经退行性疾病等领域的研究人员正在通过CRISPR-Cas9技术创建疾病的动物模型。这使得研究人员能够以更复杂的方式在更广的范围内编辑更多动物的基因。麻省大学医学院的癌症研究专家温雪(Wen Xue)正在系统地选择肿瘤基因数据，并使用CRISPR-Cas9模拟培养皿和动物细胞生长过程中的突变。

研究人员希望通过混合和匹配新的CRISPR-Cas9工具来精确操纵动物模型的基因组和表观基因组。"真正的力量是整合这些系统."道说。这可能使科学家能够学习和理解常见疾病的复杂特征。

生物工程师帕特里克·许(Patrick Hsu)于2015年在加州神圣生物研究所建立了自己的实验室，利用基因编辑技术在培养皿和狨猴体内模拟阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病。这将能够比大鼠模型更有效地复制人类疾病，但在CRISPR-Cas9消失之前，它将非常昂贵，而且过程将非常缓慢。

甚至当他设计实验来编辑第一个CRISPR-Cas9狨猴基因时，许就非常清楚这种方法只是下一项技术的“垫脚石”。“科学技术已经老去，新的又来了。你不可能永远“爱上”一项技术。他说，“你应该一直思考什么样的生物学问题有待解决。”(红枫)

《中国科学日报》(第三版国际版，2016年3月30日)

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