颜宁等解析首个真核生物钠通道近原子分辨率结构

真核生物电压门控钠离子通道的形貌图和三维电子显微结构

2017年2月10日，清华大学医学院结构生物学高级创新中心颜宁研究组在《科学》在线发表了题为“近原子分辨率下真核电压门控钠通道的结构”的长篇研究论文，首次报道了真核生物中电压门控钠离子通道(以下简称“钠通道”)的3.8分辨率冷冻电镜结构，为了解其作用机制及相关疾病的发病机制奠定了基础。

重要

在20世纪40年代和50年代，英国科学家霍奇金和赫胥黎发现了动作电位。之后，发现电压门控钠通道(Nav通道)触发动作电位，而电压门控钾通道(Kv通道)终止动作电位并返回到静止状态。从那时起，科学界就开始了对钠通道各个方面的系统研究，一直持续到今天。可以说，钠通道的研究在过去的60年中已经形成了电生理学研究的重要基石。

钠通道是所有动物电信号的主要激活键，电信号是神经活动和肌肉收缩等一系列生理过程的控制基础。在人体内，有九种已知的电压门控钠通道亚型，它们在不同的器官和生理过程中发挥作用。钠通道异常可导致一系列与神经、肌肉和心血管疾病相关的疾病，尤其是癫痫、心律失常、持续疼痛或无法感知疼痛。到目前为止，已经在人体的九种钠通道蛋白中发现了超过1000个与已知疾病相关的点突变。此外，钠通道也是许多局麻药和自然界中大量神经毒素的直接目标。许多蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒素等。所有这些都作用于钠通道并产生不良后果。

钠通道是许多国际制药公司的研究目标，具有广阔的制药前景。获得钠通道的精细三维结构对于了解其工作机理和药学意义十分重要。

技术性的困难

除了膜蛋白等常见的技术难题之外，在分析真核生物钠通道的高分辨率三维结构时，还有几个额外的“障碍”难以克服。

首先，很难获得蛋白质样品。真核生物钠通道蛋白全长约2000个氨基酸，因此很难像电压门控钾通道一样进行大量的体外重组表达。内源性钠通道通常含量极低，并且很难直接从生物组织(如电压门控钙通道)中纯化足够高质量的蛋白质样品用于结构分析。

其次，钠通道是通过折叠肽链形成的，肽链具有伪四次对称。与同四聚体的钾通道相比，钠通道很难用冷冻电镜结晶或获得结构。它们不能与钙通道等辅助亚基形成分子量较大的稳定复合物，因此增加了用电子显微镜进行结构分析的难度。

最后，真核生物钠通道包含许多灵活的区域和各种翻译后修饰，这对其结构分析提出了巨大的挑战。

因此，对真核生物钠通道结构生物学的研究远远落后于早在2003年获得的第一个具有晶体结构的电压门控钾通道。包括欧洲、美国、英国和日本在内的世界各地的几十个研究小组正在努力获得第一个真核钠通道的高分辨率结构。

穿透点

在最新的“科学”论文中，颜宁研究小组成功克服了上述瓶颈，获得了性能良好的蛋白质样品。利用单粒子冷冻电子显微镜，它重建了真核生物钠离子通道的三维结构，可以清晰地分辨大多数侧链。颜宁研究小组使用了电子显微镜，但是做了相反的事情，放弃了对大分子量蛋白质的追求，使用序列分析来选择最短的真核生物钠离子通道。通过重组技术成功获得了高表达、稳定、均一的美洲大蠊钠通道蛋白。该结构的分析为理解钠通道的离子选择性、电压依赖性激活和失活特性以及配体抑制机制提供了重要的分子基础，为解释过去60年的大量实验数据提供了结构模板，为基于结构的分子配体的发展奠定了基础。

研究团队

这项研究是由一个年轻的团队完成的。清华大学生命学院五年级博士生沈怀宗、医学院副研究员周强、医学院博士后潘孝、生命学院二年级博士生强和生命学院五年级博士生是合著者。这项研究得到了清华大学冷冻电子显微镜平台的雷建林博士、和李的大力支持。这些数据是从清华大学2009年购买的泰坦克里欧斯冷冻电子显微镜收集的。国家蛋白质科学中心(北京)清华大学冷冻电子显微镜平台和清华大学高性能计算平台分别为本次研究的数据收集和数据处理提供支持。科技部、基金委、清华大学生命科学联合中心和生物膜与膜生物工程国家重点实验室为此研究提供了资助。这项研究也得到了清华大学医学院和生命学院肖白龙、熊伟、陶喆和塞西莉亚·卡内萨等实验室的帮助。通讯员颜宁是清华大学医学院的拜尔教授和霍华德·休斯医学研究所的国际青年科学家。

铸剑十年

值得一提的是，自2007年清华大学医学院实验室成立以来，颜宁开始了对电压门控钠离子和钙离子通道的结构生物学攻击。2012年，《自然》报道了一种来自海洋细菌的钠离子通道NavRh的晶体结构处于失活状态。此后，颜宁研究小组在世界上首次报道了真核生物电压门控钙离子通道Cav1.1的高分辨率结构，为理解相关生理过程的分子机制奠定了重要基础，包括但不限于肌肉收缩偶联过程。十年后，颜宁实验室终于分析了真核电压门控钠离子通道的结构。迄今为止，所有经典的电压门控阳离子通道都有三维结构模板，由单链折叠形成的真核钙离子和钠离子通道结构都是由颜宁实验室首次获得的，该实验室在该领域确立了其团队的国际领先地位。