世界首例基因编辑克隆犬的前世今生

说到“克隆”这个词，许多人会想到克隆羊多莉，它是世界上第一只使用这种技术繁殖的动物。它标志着克隆技术的实现，在克隆技术中，生物体通过体细胞无性繁殖。随后，克隆猪、克隆牛等相继问世，克隆狗直到2005年才问世。科学界普遍认为狗是最难克隆的动物之一，该领域的技术被韩国垄断。

中国科学院广州生物医学与健康研究所研究员赖带领中材集团公司科研团队和广州生物研究所实验室团队。借助Cas9基因编辑技术，首次获得了两条基因编辑犬“苹果”和“葫芦”。此后，研究人员利用“苹果”体细胞作为克隆犬的供体细胞，优化克隆技术平台，突破技术瓶颈，成功培育出“苹果”克隆犬“龙龙”。这标志着中国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。

克隆犬体细胞很困难

史努比，世界上第一只体细胞克隆狗，于2005年在韩国出生。从那以后，犬类体细胞克隆技术一直掌握在韩国人手中，从未被其他国家突破。克隆狗是一个世界性的问题，面临许多困难:第一个问题是如何获得足够数量的成熟卵母细胞。猪、牛、羊等动物可通过体外成熟培养技术获得大量成熟卵母细胞，而犬卵母细胞体外成熟培养效率极低，只能从体内获得成熟卵母细胞。为了在体内获得成熟的卵母细胞，有必要准确掌握狗的发情和排卵时间。然而，一旦错过了发情期和排卵期，下一次机会要到上半年或一年后才能出现。准确掌握排卵时间非常困难。个体间通过血清测定孕酮的差异很大，这使得建立统一的评价标准很困难。冲洗卵子的时间太早，卵母细胞不成熟。太迟了，卵母细胞已经老化。如何准确掌握犬的发情期和排卵时间是获得高质量成熟卵母细胞的关键。

其次，一只狗平均排卵7-8个卵。排卵卵处于GV期，需要在输卵管中停留48-72小时才能达到Mⅱ期。犬卵母细胞富含脂类物质，颜色深，粘度高，显微操作困难，体细胞电融合效率低。

最后，在犬胚胎移植中，受体和供体的生殖生理阶段很难保持一致。怀孕率低，加上克隆技术本身的低效率，使得克隆犬体细胞更加困难，需要大量的财力、人力和物力。

基因编辑，魔法剪刀

2013年，一种新的基因编辑技术(CRISPR/Cas9)在全世界流行起来。它具有构建简便、基因打靶效率高的特点。有多神奇？它可以让基因想要它，想要它或不想要它，并且做他们想做的任何事情。该基因改造已在牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物和人类胚胎中成功实施。它也能在犬类基因组中发挥作用吗？怀着这样的好奇心，我们在2013年开始了狗基因编辑研究。

实验过程并不像最初设计的那样顺利，一年的努力也没有产生预期的结果。经过多次曲折和实验方案的几次改变，神奇的剪刀终于发挥了神奇的作用。2014年6月底，世界上第一个基因(MSTN)打晕了狗“大力士”，于是“天狗”诞生了。四个月后，“大力士”和“天狗”显示出超强的运动能力，“天狗”也有明显的“二头肌”特征。

魔法剪刀继续写它的魔力。2016年10月，我们开始敲除狗的APOE基因。经过初步的基础研究，实验进行得非常顺利。2016年12月29日，世界上第一只动脉粥样硬化疾病模型狗“苹果”诞生了。20天后，另一只APOE基因敲除犬Hulu诞生了。故事还在继续，魔法剪刀还在创造新的魔法。

从世界上第一只基因敲除犬到基因敲除体细胞克隆犬

这个精彩的故事必须从2012年开始。当时，最初的想法是通过基因敲除体细胞来克隆狗，这对我们来说几乎是零基础。唯一的资源是韩国人发表的一些没有具体细节的文章。起初，对狗发情和排卵时间的识别令人困惑。经过一年的不断探索，我们逐渐掌握了规则。由于基础差和实验条件的限制，以前的体细胞克隆实验没有成功。2013年，最新的第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9全面启动。我们首先想到将这项技术应用于狗的基因编辑。经过近一年的努力，世界上第一只肌生长抑制素基因敲除犬就这样诞生了。“大力士”和“天狗”的诞生让团队中的每个人都非常激动，他们的努力和坚持带来了最终的成功。从开始到成功，花了两年多的时间。在过去的两年里，每个人都经历了一次又一次的失败，正是通过对失败和坚持不懈的不断反思和改进，我们最终取得了成功。在科学研究的道路上，我们需要一种不屈不挠的精神。

基因编辑狗已经被制造出来，但是体细胞克隆还没有成功。赖研究员带领北京中谷的研发团队和广州生物研究所的实验室团队继续克服这一世界性难题。提到世界上第一只基因敲除克隆狗“龙龙”，必须从它的捐赠者“苹果”说起。“苹果”诞生于2016年12月29日。这是一只基因编辑狗，它通过Cas9技术敲除了APOE基因。“苹果”出生后，它的皮肤细胞被保存了下来。然后研究人员使用“苹果”细胞进行体细胞克隆。经过多次实验，2017年5月28日，世界上第一只基因敲除体细胞克隆狗“龙龙”诞生了，紧接着诞生了两只完全相同的克隆狗。这标志着中国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。同时，犬基因敲除体细胞克隆首次实现。