生物科普 PCR技术及其应用

一些童鞋可能不屑于聚合酶链反应，“什么？聚合酶链反应？这不是聚合酶链式反应，也不是聚合酶链式反应。我已经做了所有的套式聚合酶链反应和定量聚合酶链反应，很简单！”事实上，聚合酶链反应有许多扩展的应用。以上只是其中之一。

(1)聚合酶链反应

这是陈词滥调，为了照顾可能只知道聚合酶链反应皮毛的童鞋，让我们从聚合酶链反应的祖坟中挖掘。

聚合酶链反应可以在体外复制DNA，少量的DNA经聚合酶链反应扩增后，DNA片段的数量会大大增加。无论是化石中的古代生物和历史人物的遗骸，还是几十年前凶杀案中凶手留下的头发、皮肤或血液，只要能分离出极少量的DNA，聚合酶链反应就能用来扩增它。这也是“痕迹证据”的力量。

1)标准的聚合酶链反应体系应包括:缓冲反应液、DNA聚合酶、镁和钾离子、4种脱氧核糖核酸(A、T、C、G)、1对引物和DNA片段模板。

2)反应条件:①加热至94℃，DNA模板熔化②退火至45 ~ 55℃，③延伸至72℃。

在聚合酶链反应过程中增加的靶DNA片段的数量符合以下理论公式:

y(目的片段)= m * 2 n

(y:感兴趣的DNA片段总数)

(m:从样本开始的DNA模板数量)

(名词:聚合酶链反应循环)

例如，有100个模板，然后经过30轮循环，将有100 * 2 30 = 107，374，182，400个目标段。

那么为什么要进行这种计算呢？聚合酶链反应的原理是，孩子们可以直接点击视频观看，这比x兄弟的打字技术更生动、更好。

㈡凯利·穆利斯

发明聚合酶链反应技术的人一定知道一些童鞋，但他可能不知道发生了什么。他的名字叫凯利·穆利斯。

1979年，在加州大学工作了7年的穆利斯从未获得过高级职称。最后，他厌倦了那里的生活，出去找工作。当他进入塞特斯一家从事DNA疫苗和DNA诊断的公司时，他进入了核酸合成办公室。一开始，穆利斯非常勤奋，愿意工作，但他厌倦了。大量重复的工作使他很痛苦。最后，在81年，他成为了办公室主任，这也是一个小领导。最后，事情变得简单了。

1983年，当七叶树开花的时候，穆利斯正在去乡下的路上，开着他的车沿着公路飞奔，就像一条延伸的脱氧核糖核酸链，他突然想到了聚合酶链反应的雏形。

很快，穆利斯正式发表了一份关于聚合酶链反应原理的学术报告，很少有人相信。

然而，穆利斯亲自尝试了这个实验，并以“好运”的方式进行了世界上第一次聚合酶链反应实验，编号为聚合酶链反应01，但没有成功。10月，进行了聚合酶链反应02实验，但仍然失败。

几周后，塞特斯召开会议讨论是否驱逐穆赫里斯。因为他的创新想法很难实现，在公司制造混乱，与其他实验室员工发生性关系，用枪威胁他女朋友的约会同事，等等。然而，公司最终决定留在穆利斯，成立一个聚合酶链反应团队，给他一年时间完成聚合酶链反应技术开发的任务，否则就说再见。

1984年11月15日，聚合酶链反应实验成功，然后下一步是申请专利和提交论文。一篇正式介绍聚合酶链反应原理的论文被送到《自然》杂志并被拒绝。所有的作者都震惊了，回到了《科学》，仍然拒绝写作。最后不得不改由吴瑞担任《酶学方法》杂志的编辑(这样一项伟大的发明被科学所不接受吗？这没什么。在那些日子里，《科学》没有收到高三的文章。四年后，霍夫曼-拉什公司投资3亿美元购买聚合酶链反应技术，而塞特斯公司破产，令人费解。

收到无尽的版税后，穆利斯开始享受他的生活。他在家乡买了一片牧场，成了一名农民。他从此过着幸福的生活。

这个故事告诉我们:科学不接受如此伟大的发现吗？我们还不想投票，让你后悔吧。

(3)聚合酶链反应仪出现前的聚合酶链反应实验

众所周知，聚合酶链反应的温度过程是一个变性(95℃)退火(45~55℃)延伸(70~75℃)的重复循环。切换时间也很短，从几十秒到2分钟不等。这是PCR扩增仪的主要工作原理。

据我的导师说，他们出国留学后，当时没有PCR扩增仪。他们用于聚合酶链反应扩增的工具只有一把镊子、一个多孔水浴和一个计时器。充分发挥你的想象力。为了做一个脱氧核糖核酸扩增实验，计时器不停地叫，你的手总是准备冲刺，聚合酶链反应管不断地在三个水浴槽之间跳跃，这给你一种画面感。

(4)聚合酶链反应技术的推广应用

原位聚合酶链反应技术

原位聚合酶链反应结合了聚合酶链反应和原位杂交的优点。它是一种在组织切片或细胞涂片上原位扩增特定DNA或核糖核酸，然后用特定探针进行原位杂交检测的方法。

细胞膜和核膜具有一定的渗透性，聚合酶链反应扩增所需的各种成分可以进入细胞或细胞核，原位扩增特定的核酸或核糖核酸。扩增产物由于分子量大，不容易通过细胞膜向外扩散或相互交织，因此它们保持原位。

APCR锚定聚合酶链反应技术

原理:通过酶法将一个已知的序列添加到通用引物逆转录cdn的a3’端，然后将该序列作为引物结合位点扩增cdn，称为APCR。

应用:可用于未知或完全已知序列的扩增，如未知cDNA的制备和低丰度cDNA文库的构建。

不对称聚合酶链反应

两种引物浓度比相差很大的聚合酶链反应技术称为不对称聚合酶链反应。在扩增循环中引入不同的引物浓度，比例通常为50-100∶1。在最初的10-15个循环中，主要产物是双链DNA，但是当低浓度引物被消耗时，由高浓度引物介导的聚合酶链反应将产生大量的单链DNA。

应用:单链DNA片段可以作为探针用于序列分析或核酸杂交。

逆转录聚合酶链反应技术

当扩增模板是核糖核酸时，需要在扩增前通过逆转录酶将其反转录成cDNA。逆转录聚合酶链反应广泛应用于分子生物学和临床检验。

巢式pcr技术

首先用目标序列的一对外部引物进行扩增，增加模板数量，然后用一对内部引物进行扩增，得到特异性的聚合酶链反应条带，即套式聚合酶链反应。

等位基因特异性聚合酶链反应技术

ASPCR依赖于引物3’端的碱基错配，这不仅降低了聚合酶的延伸效率，还降低了引物-模板复合物的热稳定性。

突变少的模板经聚合酶链反应扩增后不能检测扩增产物，可用于检测基因点突变。

多重聚合酶链反应技术

原理:在同一反应中，使用多套引物同时扩增几个基因片段。如果基因的某个片段被删除，相应电泳图谱上的区域就会消失。

用途:复合聚合酶链反应主要用于同一病原体的分型，同时检测多种病原体和多点突变的分子疾病。

重组聚合酶链反应技术

重组聚合酶链式反应技术是在两个聚合酶链式反应扩增体系中，两对引物分别在5’端和3’端引物中的一个上具有互补序列，将两个聚合酶链式反应扩增产物混合，经过变性和复性后，两组聚合酶链式反应产物的互补序列粘附在一起，一条重组杂交链在聚合酶链式反应条件下可以发生聚合延伸反应，生成含有两个不同基因的杂交基因。

定量PCR技术

这也是一个非常熟悉的方法。qPCR可用于研究基因表达，并可提供特定DNA基因表达水平的变化，在癌症、代谢紊乱和自身免疫性疾病的诊断和分析中具有重要价值。

竞争聚合酶链反应技术

碳-聚合酶链反应技术是竞争的同时扩增的cDNA模板和靶cDNA，使用相同的引物，但一旦扩增，它可以区别于这些靶cDNA。通常使用突变体竞争性cDNA模板，其序列与感兴趣的cDNA序列相同，但模板中只有一个新的内位点或缺少内位点。

这种方法可以准确地确定靶序列的cDNA中的mRNA，并可用于定量的mRNA在几个至10个细胞。