基因编辑如何摆脱“脱靶”困扰

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应金双霞为画

金双霞在中国中部农作物遗传改良国家重点实验室查阅了由基因编辑的棉花材料。

基因组编辑技术是当前生命科学研究的前沿领域。CRISPR/Cas9系统是各种基因组编辑方法中最方便、最有效、应用最广泛的一种。

然而，CRISPR技术的脱靶效应仍然是影响其广泛应用的主要限制因素。如何正确评价和检测缺失效应，并提出相应的策略来降低缺失效应，是基因编辑研究领域的一个重要研究方向。

最近，华中农业大学棉花遗传改良小组做了相关综述，系统总结了当前的基因编辑工具、基因编辑产生的脱靶效应的类型和类型、脱靶效应的机理以及动植物脱靶效应存在的问题。总结了如何设计sgRNA、评估和预测缺失效应、避免和减少缺失效应的策略以及对预期基因组编辑结果的影响。该论文在线发表在国际综合杂志《高级科学》上。

虽然基因编辑很好，但目标缺失是个问题。

与以往研究基因功能的工具相比，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑具有更高的效率和准确性，但也带来了潜在的“致命”问题遗漏效应。

“基因编辑可以‘指哪种类型和哪种类型’。一般来说，只需要20个核苷酸序列来定位和剔除一个基因。然而，与此同时，基因组序列中有许多碱基片段与特定的20个核苷酸序列相似。在基因编辑的过程中，非常接近目标核糖核酸的片段也将被结合和剔除，这被称为“脱靶”。华中农业大学植物科学与技术学院教授、该论文的合著者金双霞在接受《中国科学日报》采访时解释道。

金双霞强调，由于可以绑定的潜在缺失位点的基因片段相对较短，理论上缺失概率仍然比较高，缺失位点也相对较多。如果失误普遍发生，这将是对动植物的严重挑战，后果将更加严重。

电子科技大学生命科学与技术学院教授张勇认为，基因组编辑技术在动植物育种和基础研究中非常重要。然而，脱靶效应和非特异性剪切对应用结果和研究结果的可靠性和有用性有重要影响。目前，对基因编辑技术的应用和发展有很多评论，但对缺失效应的综合评论却很少

“长期以来，学术界对植物基因编辑器和基因编辑工具的缺失效应没有给予足够的重视。”安徽省农作物基因编辑中心主任、安徽省农业科学院水稻研究所研究员魏鹏程表示，该综述很好地结合了动物基因编辑技术的前沿进展和植物基因编辑面临的问题，并指出今后在缺失效应方面应做的工作。

四种漏检方法

根据本文，在基因编辑领域可以采取以下策略来减少缺失效应:开发和合理利用预测缺失效应的有效工具，开发新的基因编辑系统，设计具有高质量参考基因组和良好基因编辑工具递送系统的目标。"使用上述技术策略可以有效地减少或避免失误."金双霞说道。

缺失检测最简单和最有效的方法之一是全基因组测序。通过软件预测潜在的缺失位点，然后测量和比较基因组。如果与受体材料相比，潜在的缺失位点没有变化，则证明没有缺失，如果有变化，则可能有缺失，这可以通过经典的桑格测序方法进一步验证。"这是目前非常简单、有效和全面的方法."金双霞说道。

开发新的基因编辑系统是为了从技术来源的角度避免遗漏。目前，有一些新的CRISPR/Cas系统。与最常用的CRISPR/Cas9系统相比，它具有更高的精度，并能显著降低脱靶效应。

由于基因编辑中的基因组是由成千上万个通过基因组测序获得的小片段拼接而成，由于早期测序技术和拼接策略的限制，许多物种在其早期版本的基因组中存在错误。编辑这样的基因组就像阅读一本充满错误的书，这自然会导致误解。因此，没有一个好的参考基因组，很容易错过目标。

“最理想的状态是在编辑每个品种的基因组时，使用该品种的参考基因组作为目标设计。”金双霞说，即使在同一物种中，不同品种和品系之间也存在相当大的遗传差异，这将对靶位的遗漏和基因编辑的准确性产生很大影响。

一个好的基因编辑工具的传递系统应尽可能避免或减少组织培养引起的体细胞克隆变异，也是减少遗漏或提高基因编辑准确性的重要策略。

基因编辑工具的未来展望

据张勇说，这一审查是非常明确的基本概念和全面的方法。同时，它也非常贴近实际的研究工作，“不是从理论到理论，读完别人的作品后再做文献综述，而是与第一线工作相结合。”

这篇综述总结了现有的研究工作，梳理了脱靶效应概念的历史，并对脱靶效应概念进行了系统全面的分类。在方法层面，从实验的角度全面系统地阐述了利用不同的基因编辑技术检测缺失效应的效率和可行性。利用生物信息学和人工智能数据分析预测和评估脱靶效应；如何减少遗漏效应，提高基因编辑的准确性张勇说。

目前，三种最流行的基因编辑工具是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应子核酸酶(TALEN)和串联短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统，其中CRISPR/Cas是最有效和应用最广泛的，但其失败率也相对较高。就准确性而言，TELEN表现最佳。

自20世纪90年代以来，生物学开始使用ZFN技术。TALEN技术出现在2000年之后。“早期的基因编辑技术都是蛋白质分层，也就是说，在释放蛋白质的过程中，将蛋白质转移到细胞中所消耗的能量非常大。”魏鹏程表示，尽管TALEN技术目前在保真度和准确性方面优于CRISPR/Cas，但就能量消耗和构建药物的成本而言，CRISPR/Cas应该是基因编辑技术未来发展的一个关键点。

金双霞还认为，虽然目前三种主流工具的应用处于互补状态，但一些科研机构会同时使用这三种工具。CRISPR/Cas在未来有更大的发展潜力。

“CRISPR/Cas基因编辑工具目前面临着保真度和准确性不足的问题，应在后续开发中加以克服。”魏鹏程在此基础上判断的理由是，早期的CRISPR蛋白主要是从自然生物中筛选出来的，不是根据需要人工选择的，因此可能会产生部分脱靶效应。一旦添加了人工选择，保真度就可以轻松进化。“未来的发展趋势将是CRISPR/Cas技术的逐步完善，这将弥补其存在的一些问题，如保真度的缺陷。”(韩天棋)

相关论文信息:https://doi.org/10.1002/advs.201902312